厭氧消化處理玉米秸稈酶解殘渣對木質(zhì)素的影響研究

趙昆煬，高雄輝，祝其麗，湯曉玉

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學研究所，成都610041）

木質(zhì)素是自然界中含量僅次于纖維素的第二大高分子聚合物，全球每年可利用的木質(zhì)素約為3 000億t[1]。木質(zhì)素是由松柏醇、介子醇和香豆醇3 種苯丙烷單體通過碳-碳鍵和醚鍵等連接形成的無定形聚合物[2]。作為自然界中唯一可再生的芳香族化合物來源，木質(zhì)素近年來受到越來越多的關(guān)注。基于其獨特的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，木質(zhì)素可廣泛用于生產(chǎn)分散劑、抗紫外涂層和碳纖維等化工原料以及生物基材料[3]。此外，近幾年研究者們致力于開發(fā)催化裂解、水解、氧化和還原等方法將木質(zhì)素解聚成單體，再轉(zhuǎn)化成為高值產(chǎn)品[4]。這些方法大多數(shù)要求分離獲得的木質(zhì)素能保留其天然結(jié)構(gòu)（如β芳醚鍵）。盡管如此，目前木質(zhì)素的商業(yè)化利用率不足5%[5]，絕大多數(shù)被作為低價值燃料直接用于產(chǎn)熱或發(fā)電。

以農(nóng)作物秸稈等為原料的第二代生物燃料（也稱纖維素乙醇）是近年來生物質(zhì)能源的重要發(fā)展方向。在纖維素乙醇的生產(chǎn)過程中，大部分纖維素和半纖維素被酶水解后，會產(chǎn)生大量富含木質(zhì)素的酶解殘渣（約占原料總量的25%～35%）[6]。采用適當?shù)姆椒◤闹谢厥漳举|(zhì)素，用于生產(chǎn)高值化學品，可顯著地提高原料的利用率。酶水解條件相對溫和，對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的影響很小[7]，故酶解殘渣木質(zhì)素適合于上述高值利用；但是其中糖類和灰分等雜質(zhì)會嚴重影響木質(zhì)素的熱化學轉(zhuǎn)化效率。因此，發(fā)展經(jīng)濟可行又能滿足木質(zhì)素利用要求的分離方法就顯得尤為重要。目前，常用的木質(zhì)素分離回收方法包括化學分離法和溶劑萃取法等。傳統(tǒng)的化學制漿方法或秸稈預處理技術(shù)均會不同程度地改變木質(zhì)素的天然結(jié)構(gòu)，如稀酸預處理或堿法制漿過程極易破壞天然木質(zhì)素的β芳醚鍵，使其發(fā)生縮合反應形成極難被斷裂的C-C 鍵[8-11]，不利于后續(xù)的解聚反應。有機溶劑萃取法對木質(zhì)素的修飾較小且選擇性高，但溶劑難以回收且成本過高是其大規(guī)模商業(yè)化應用的主要阻礙。

厭氧消化是一種成熟的有機廢棄物處理技術(shù)，近年來被廣泛用于降解農(nóng)作物秸稈、能源植物等纖維素類原料來生產(chǎn)沼氣。厭氧發(fā)酵微生物中的水解菌能專門作用于纖維素的分解，而幾乎不降解木質(zhì)素聚合物[12]。另一方面，由于纖維素原料具有天然抗降解性，水解是其厭氧消化的限速步驟，會直接影響甲烷生成[13]。課題組前期的研究[14-15]表明，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，酶解殘渣中未分解的纖維素和半纖維素可以被厭氧微生物有效降解并轉(zhuǎn)化為沼氣?；诖耍疚奶岢隼脜捬跸姆椒◤拿附鈿堅懈患举|(zhì)素。如前所述，木質(zhì)素的分離過程會極大地影響其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，進而決定其質(zhì)量和應用價值，而目前探求厭氧消化對酶解殘渣木質(zhì)素影響的相關(guān)研究較少。因此，本文考察了厭氧消化對秸稈酶解殘渣組成成分的影響，并采用多種表征手段對比分析了厭氧消化前后木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)和熱化學性質(zhì)，旨在考察厭氧消化處理玉米秸稈酶解殘渣對木質(zhì)素的影響，為酶解殘渣木質(zhì)素的進一步純化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用的玉米秸稈酶解殘渣（Unhydrolyzed solid，UHS）由美國密歇根州立大學生物質(zhì)轉(zhuǎn)化實驗室提供，其主要成分包括：木質(zhì)素（64.68%）、葡聚糖（8.44%）、木聚糖（4.18%）和灰分（4.44%）。其制備方法為：首先將玉米秸稈在優(yōu)化的氨纖維爆破（Ammo?nia fiber expansion，AFEX）[16]條件下進行預處理，然后利用復合纖維素酶水解168 h，詳細的預處理和酶水解條件參照文獻[17]進行。酶水解后通過離心分離去除水解液得到酶解殘渣，并用去離子水洗滌兩次，去除殘留的可溶性糖和其他雜質(zhì)，最后將得到的酶解殘渣在80 ℃下烘干過夜，研磨過80目篩備用。

1.2 厭氧消化

厭氧消化試驗采用課題組前期確立的優(yōu)化發(fā)酵條件[14-15]：以餐廚垃圾厭氧消化污泥作為接種物，溫度35 ℃，體系總固體量（Total solids，TS）=2%，按揮發(fā)性固體（Volatile solids，Vs）計算接種物∶底物=2∶1，調(diào)節(jié)初始pH 至7.2 左右。接種物和底物（酶解殘渣）的性質(zhì)：TS 分別為1.48%和94.55%，VS 分別為1.11%和91.42%，接種物VS添加量為2.70 g，底物VS添加量為1.35 g，其詳細組成成分見表1。厭氧消化在總體積為610 mL 的厭氧瓶中進行，實際發(fā)酵液體積為250 mL，裝樣混合后利用氮氣吹脫排空。試驗共設置24個樣品，分別用于第0、2、4、8、16、22 d 及發(fā)酵終點取樣測定固體成分，每個時間點設置3 個平行樣；以只添加接種物為對照組。發(fā)酵周期為34 d，每2 d 測定甲烷含量及氣體組分。分別在第0、2、4、8、16、22 d將發(fā)酵的血清瓶取出并停止發(fā)酵，再將發(fā)酵殘余固體烘干備用。發(fā)酵結(jié)束后將厭氧消化殘渣（Anaerobic digested unhydrolyzed solid，ADUHS）和對照組取出，將所有固體樣品烘干、研磨過80目篩。

1.3 表征木質(zhì)素的制備

結(jié)合Meyer 等[18]和Holtman 等[19]的方法略微調(diào)整后制備表征木質(zhì)素（STD lignin）。首先將酶解殘渣和厭氧消化殘渣用二惡烷∶水（96∶4，V/V）在搖床中以100 r·min-1、27 ℃、黑暗條件下萃取24 h。同一樣品重復萃取3 次，每次溶劑的用量為200 mL·g-1固體。每次萃取后采用減壓法除去溶劑。然后將固體木質(zhì)素溶于少量90%乙酸中并在去離子水（約乙酸用量的20 倍）中沉淀。將沉淀的木質(zhì)素離心分離除去上清后冷凍干燥，再溶于盡可能少的1，2-二氯乙烷∶乙醇（2∶1，V/V）中。最后在正己烷中沉淀分離，再用冷正己烷洗滌。將樣品在40 ℃條件下干燥過夜。

1.4 分析方法

1.4.1 固體樣品的成分分析

按照美國國家可再生能源實驗室（NREL）建立的標準方法分析固體樣品中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和灰分[20-22]。使用高效液相色譜（HPLC）分析酸水解液中的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。HPLC 系統(tǒng)為Agilent Technologies 1200 series，配備Aminex HPX-87H 色譜柱，檢測器為RID，柱溫箱和檢測器的溫度均為35 ℃。流動相為5 mmol·L-1H2SO4水溶液，流速為0.6 mL·min-1。

1.4.2 元素分析

稱取0.2 g 樣品加入5 mL 濃硫酸，設置不加樣品組為對照，隔夜放置后，按照以下步驟進行消解：在加熱至120 ℃保持30 min 后取出混合均勻，此后每升溫60 ℃均保持30 min然后取出混合均勻，直至300 ℃保持30 min 后滴加0.5 mL 過氧化氫；之后保持300 ℃并每隔20～30 min 滴加一次過氧化氫直至樣品完全澄清、完全消解為止；消解完成后稀釋，再采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）測定微量元素，儀器為德國耶拿的Plasma PQ9000。

1.4.3 甲烷產(chǎn)量分析

采用壓力法測定沼氣產(chǎn)量。利用氣相色譜測定沼氣成分，色譜條件如下：儀器型號為GC 122，色譜柱為TDX-01，檢測器為熱導檢測器，柱箱溫度135 ℃，進樣器溫度135 ℃，檢測器溫度150 ℃，載氣為氫氣，壓力150 kPa，流速0.12 L·min-1，進樣體積為500 μL。

1.4.4 凝膠色譜分析

根據(jù)文獻報道的乙?；幚矸绞絒4，18]，對樣品進行乙?；幚恚簩?5 mg樣品溶解于2 mL無水乙酸和吡啶（1∶1，V/V）混合溶液中，并在室溫下攪拌過夜，再加入5 mL 無水乙醇攪拌30 min 使其冷卻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，多次重復上述步驟，直到乙酸和吡啶被全部去除。將乙?；臉悠啡芙獾缴倭康穆确轮?，然后逐滴加入到乙醚中以沉淀樣品。離心分離固體，重復洗滌和分離步驟3次確保除去氯仿，再將樣品于40 ℃下真空干燥過夜。

將乙?；幚砗玫臉悠啡芙獾?.5 mg·mL-1的四氫呋喃（Tetrahydrofuran，THF）中，再用0.45 μm 尼龍膜過濾。凝膠色譜分析（Gel chromatography，GPC）使用Water 1515系統(tǒng)進行，配有視差折光檢測器和兩個MIXED-C 7.5X300 柱。色譜條件為：溫度35 ℃，洗脫液THF，流速1 mL·min-1。最后采用分子量范圍為1.5×103～3.6×106g·mol-1的6 種窄分布的聚苯乙烯標品制備標準曲線。

1.4.5 熱重分析

稱取5 mg 樣品（±0.001），使用TGAr Q500熱重分析儀器分析木質(zhì)素樣品的熱力學性質(zhì)。在氮氣氛圍中以20 ℃·min-1升溫速率加熱樣品，測試溫度為室溫到800 ℃。

1.4.6 傅里葉紅外分析

稱取30 mg 樣品采用1%的KBr 壓片法制片，檢測儀器為Thermo Nicolet 6700，掃描次數(shù)為16 次，分辨率為4。

1.4.7 核磁氫譜分析

取30 mg 木質(zhì)素樣品，溶解于0.5 mL 的DMSO-d6中，使用Bruker AV Ⅱ-600 MHz超導核磁對樣品進行檢測，測試溫度為室溫，掃描次數(shù)為32次。

2 結(jié)果與討論

2.1 厭氧消化過程秸稈酶解殘渣中主要成分變化及物料平衡

為了考察發(fā)酵過程酶解殘渣中木質(zhì)素和聚糖的降解情況，分析了厭氧消化殘渣的主要組成成分隨時間的變化（圖1），圖中各時間點的組成折算成基于發(fā)酵初始時刻固體總量的相對值。從圖中可以看出，固體殘渣的總量隨著厭氧消化的進行逐漸減少。第0 d到第8 d，葡聚糖的相對含量從0.044 g·g-1（ADUHS）下降到0.036 g·g-1，在此后的26 d，進一步下降到0.028 g·g-1，然后基本保持穩(wěn)定。在厭氧消化過程木聚糖的相對含量從0.026 g·g-1緩慢降低到0.021 g·g-1。相反，在整個過程不溶性木質(zhì)素和灰分的相對含量基本不變，分別為0.43 g·g-1和0.21 g·g-1。秸稈酶解殘渣中的糖類主要是不能被真菌酶制劑所分解的難降解性糖類，從結(jié)果可以看出大部分的殘?zhí)悄苤饾u被厭氧微生物降解。從圖中也可以看出，酶解殘渣中糖類的降解程度主要取決于發(fā)酵時間。與其他的木質(zhì)素分離方法[4，18]相比，本研究采用的生物方法雖然需要的時間更長（至少8～15 d），但對酶解殘渣中的殘?zhí)侨コ^為徹底，這有助于減少糖類對木質(zhì)素熱化學轉(zhuǎn)化的影響。

酶解殘渣中的聚糖被降解后進一步轉(zhuǎn)化為沼氣。在本試驗條件下，整個產(chǎn)氣過程約持續(xù)34 d：前10 d左右隨著聚糖被迅速消耗，產(chǎn)氣速率較快，累計甲烷產(chǎn)量迅速增加；此后糖耗速率逐漸變慢，產(chǎn)氣在22 d左右進入平緩期直至結(jié)束。厭氧消化結(jié)束時約有42%的聚糖被降解，最終累計產(chǎn)生甲烷103.20 mL·g-1VS（UHS）。

圖1 厭氧消化過程消化殘渣中主要組成成分變化Figure 1 The change of ADUHS main composition during anaerobic digestion

秸稈酶解殘渣以及厭氧消化殘渣的主要成分含量如表1 所示。由于引入了接種物且接種物中木質(zhì)素和聚糖含量均低于酶解殘渣，導致初始時刻固體殘渣中聚糖的含量較酶解殘渣降低，但同時也導致了木質(zhì)素的含量下降（表1）。通過厭氧消化將殘?zhí)沁M一步降解后，發(fā)酵終點厭氧消化殘渣中的聚糖和木質(zhì)素的含量分別為5%和40%（表1）。從表1 中也可以看出，厭氧消化殘渣中灰分含量高于酶解殘渣，對比接種物的組成成分可知，消化殘渣中大部分的灰分來自于接種物。本研究采用的接種物為餐廚垃圾消化污泥，而餐廚垃圾具有高鹽的特性，在厭氧處理過程中鹽分可能被累積，因此使用該種污泥作為接種物難免會引入大量灰分。采用ICP 對灰分的組成進行了分析，結(jié)果顯示接種物的引入會導致Ca、Fe、K、Mg、Mn、Zn 和Al 等元素的含量有所增加，但消化殘渣中不含有極難除去的Si元素，這一特性有利于后續(xù)對木質(zhì)素的進一步分離純化。

圖2 顯示了厭氧消化過程的質(zhì)量平衡，以處理100 g酶解殘渣為基礎(chǔ)，接種比例RI/S（基于VS）為2∶1。從圖中可以看出，厭氧消化后固體總量有所減少，主要是由于酶解殘渣中的聚糖被降解為甲烷和二氧化碳。消化前后固體殘渣中的木質(zhì)素總量基本保持恒定，說明該過程幾乎不存在木質(zhì)素的質(zhì)量損失，因此木質(zhì)素的回收率可以接近100%。

圖2 厭氧消化處理秸稈酶解殘渣過程的物料平衡Figure 2 Mass balance in the process of UHS anaerobic digestion

表1 接種物、酶解殘渣和厭氧消化殘渣的主要組成成分（%）Table 1 The main composition of inoculum，UHS and ADUHS（%）

2.2 厭氧消化對酶解殘渣中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響

2.2.1 分子量大小

木質(zhì)素的分子量大小是決定其物理性質(zhì)、機械性能以及流體行為的重要參數(shù)，從而影響其應用。常見的化學方法或高溫萃取等分離手段通常會引起木質(zhì)素分子間的裂解或縮合等反應，導致分離木質(zhì)素的分子量發(fā)生變化。本研究利用凝膠色譜法（GPC）分析厭氧消化前后殘渣中木質(zhì)素的分子量變化。其相對分子質(zhì)量及分布如表2所示。比較兩者數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：消化殘渣中木質(zhì)素重均分子量（Mm）有所下降，由6 408降低為4 429，表明厭氧消化對木質(zhì)素的分子量存在一定的影響。這種變化一方面可能是由于引入了含有木質(zhì)素的接種物；另一方面可能是厭氧微生物的作用導致木質(zhì)素具有更小的形態(tài)和體積，使其分子量減少。但由于消化前后木質(zhì)素的總量未發(fā)生改變，這種作用可能僅會影響木質(zhì)素的分子量大小。表中酶解殘渣中木質(zhì)素的分散度為2.77，這與文獻中報告的二惡烷萃取木質(zhì)素數(shù)值相似[18]。此外，經(jīng)過厭氧消化后固體殘渣中的木質(zhì)素分散度有所下降，表明其分子量分布范圍變窄，結(jié)構(gòu)更加均一化。而分子量大小和結(jié)構(gòu)均一的高聚物片段往往具有相似的性質(zhì)，因此這種均一化、碎片化現(xiàn)象可能更利于木質(zhì)素后續(xù)的分離和利用。

表2 酶解殘渣和消化殘渣中木質(zhì)素的相對分子質(zhì)量及分布Table 2 The relative molecular mass and distribution of lignin in UHS and ADUHS

2.2.2 熱重分析

木質(zhì)素的熱化學性質(zhì)是影響其熱化學轉(zhuǎn)化效率的另一重要因素。采用熱重分析對比了兩種木質(zhì)素的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3?？傮w來看兩種木質(zhì)素的熱分解趨勢極其相似：大部分的質(zhì)量損失均出現(xiàn)在200～500 ℃，并在300～400 ℃質(zhì)量損失速率達到最大；600 ℃過后殘余質(zhì)量幾乎不變。但從圖中可以看出，消化殘渣木質(zhì)素的熱損失量始終大于酶解殘渣木質(zhì)素，表明酶解殘渣木質(zhì)素比消化殘渣木質(zhì)素更加耐高溫。其次，消化殘渣木質(zhì)素熱分解速率相較于酶解殘渣木質(zhì)素更快。結(jié)合GPC 的結(jié)果分析，可能是由于消化殘渣木質(zhì)素的分子量更低，導致其熱穩(wěn)定性有所下降。但分子量的變化對熱穩(wěn)定性的影響有限，在達到800 ℃質(zhì)量趨于恒定后，酶解殘渣木質(zhì)素殘留量僅比消化殘渣木質(zhì)素多6%左右。

圖3 酶解殘渣木質(zhì)素和消化殘渣木質(zhì)素的熱重曲線Figure 3 The TGA curves of the lignin from UHS and ADUHS

圖4 酶解殘渣和消化殘渣中木質(zhì)素的紅外譜圖Figure 4 The FTIR spectra of lignin from UHS and ADUHS

2.2.3 傅里葉變換紅外分析

兩種木質(zhì)素的紅外光譜結(jié)果如圖4 所示，根據(jù)相關(guān)報道[23-26]得出圖4中對應的紅外吸收峰歸屬（表3）。從圖中可以看出，兩種木質(zhì)素的紅外吸收譜圖十分相似，只是在一些吸收峰強度上存在細微差異，在3 430、2 926、2 847 cm-1和1 030 cm-1處的吸收峰有不明顯的區(qū)別。圖中3 430 cm-1處的峰為—OH 的伸縮振動吸收峰；2 926 cm-1和2 847 cm-1處的峰為C—H的伸縮振動吸收峰；其中較為關(guān)鍵的1 610、1 512、1 461 cm-1和1 424 cm-14 處的峰為芳香環(huán)特征吸收峰，譜圖顯示兩種木質(zhì)素在該區(qū)域的吸收強度并無明顯區(qū)別，表明木質(zhì)素的主要結(jié)構(gòu)未因厭氧處理而發(fā)生改變；1 325 cm-1為紫丁香基中伸縮振動吸收峰；1 223 cm-1處的峰可能為C—C、C—O或的伸縮振動吸收峰；1 127 cm-1處的峰為芳香環(huán)骨架振動吸收峰；1 030 cm-1處的峰為愈創(chuàng)木基特征吸收峰；832 cm-1處峰為芳香環(huán)特征吸收峰。從紅外光譜看出，厭氧消化前后固體殘渣中木質(zhì)素在分子結(jié)構(gòu)上不存在顯著差異，表明厭氧消化對木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)影響較小，能夠較好地保留木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)。

表3 兩種木質(zhì)素的紅外吸收峰歸屬Table 3 The FTIR assignments of the lignin from UHS and ADUHS

2.2.4 一維核磁氫譜分析

木質(zhì)素中的含氫官能團（芳香環(huán)、羥基、甲氧基等）決定了木質(zhì)素的化學性質(zhì)，根據(jù)相關(guān)報道[26-29]，利用一維核磁氫譜對兩種木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)進行表征，考察厭氧處理對這些官能團造成的潛在影響。圖5 為兩種木質(zhì)素的1H-NMR 譜圖，可以發(fā)現(xiàn)兩種木質(zhì)素的峰形和出峰位置均十分相似。其中圖5 中δ=8.4～6.0 區(qū)域內(nèi)的化學位移歸屬于愈創(chuàng)木基、紫丁香基和對羥基苯基中芳香環(huán)的質(zhì)子，即木質(zhì)素基本單元的質(zhì)子；δ=5.2～4.5 區(qū)域內(nèi)的化學位移歸屬于β-O-4 中的質(zhì)子；δ=3.9～3.2 區(qū)域內(nèi)的化學位移歸屬于甲氧基中的質(zhì)子；δ=2.5 為溶劑（DMSO-d6）的峰；δ=2.5～2.2 區(qū)域內(nèi)的化學位移歸屬于酚羥基中的質(zhì)子；δ=2.2～1.5 區(qū)域內(nèi)的化學位移歸屬于脂肪族羥基中的質(zhì)子；δ=1.5～0的化學位移歸屬于脂肪族側(cè)鏈中的質(zhì)子。對比譜圖可以看出位于δ=6.75 和δ=5.2 處的峰形，出峰位置幾乎未改變，說明酶解殘渣和消化殘渣中木質(zhì)素都是以愈瘡木基團和β-O-4 為主要結(jié)構(gòu)，且厭氧消化后這些主要官能團僅略微減少，因此厭氧處理較好地保留了木質(zhì)素的主要官能團結(jié)構(gòu)。

圖5 酶解殘渣與消化殘渣木質(zhì)素的1H-NMR譜圖Figure 5 The 1H-NMR spectra of lignin from UHS and ADUHS

3 結(jié)論

（1）采用厭氧消化的方法處理秸稈酶解殘渣，消化殘渣中聚糖含量顯著降低而木質(zhì)素總量基本不變。但厭氧過程引入的接種物導致消化殘渣木質(zhì)素灰分升高。

（2）厭氧處理后木質(zhì)素的熱化學性質(zhì)和結(jié)構(gòu)無明顯變化。凝膠滲透色譜結(jié)果顯示處理后木質(zhì)素的分子量有所降低，但熱重分析結(jié)果表明消化前后木質(zhì)素熱化學穩(wěn)定性無顯著變化。綜合紅外光譜和一維核磁共振氫譜結(jié)果顯示，消化殘渣中木質(zhì)素的主要鏈接鍵仍為β-O-4 鍵，且厭氧處理前后木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)相差不大，該方法能夠較好地保留木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)。