華北地區(qū)不同規(guī)模畜禽養(yǎng)殖場糞便中抗生素抗性基因污染特征

鄒威，金彩霞，魏閃，Ramasamy Rajesh Kumar，周啟星*

（1.河南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，黃淮水環(huán)境污染與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，河南省環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗室，水處理關(guān)鍵技術(shù)國際聯(lián)合實(shí)驗室，河南 新鄉(xiāng)453007；2.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室/天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗室，天津300350）

我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國，總量一直居于全球首位[1]。一直以來，抗生素被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的動物疾病預(yù)防和治療[2-3]。據(jù)專家調(diào)查和推算，中國每年生產(chǎn)抗生素原料大約21 萬t，其中9.7 萬t 應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，占年產(chǎn)抗生素總量的46.1%。進(jìn)入到動物體內(nèi)的抗生素只有少部分能被代謝、吸收和降解，大部分殘留在動物糞便中[4-7]，對腸道微生物造成選擇性壓力，動物體內(nèi)存在的抗生素抗性細(xì)菌（Antibiotic resistant bacteria，ARBs）和抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs），不僅極大阻礙畜禽養(yǎng)殖糞便的有效資源化利用，更可能給周邊生態(tài)環(huán)境帶來潛在的健康風(fēng)險[8-10]。

畜禽糞便的排放造成大量攜帶ARGs 的抗性細(xì)菌進(jìn)入到水和土壤環(huán)境，通過水平接合轉(zhuǎn)移將抗性傳遞給土著微生物，甚至進(jìn)入食物鏈，給生態(tài)和人類健康帶來嚴(yán)重威脅[11-13]。當(dāng)前針對畜禽養(yǎng)殖場（雞、豬、牛和羊等）及周邊環(huán)境ARGs 污染情況的調(diào)研已有大量報道[14-19]。例如，Tina 等[20]研究比利時畜禽糞便中抗生素和ARGs 遷移行為，發(fā)現(xiàn)豬糞樣品中以四環(huán)素類（tetB、tetL、tetM、tetO、tetQ 和tetW）、磺胺類（sulⅡ）和大環(huán)內(nèi)酯類（ermB 和ermF）抗性基因為主；Haley等[21]調(diào)查發(fā)現(xiàn)美國17 個商業(yè)奶牛場養(yǎng)殖糞便ARGs以四環(huán)素類和氨基糖苷類最為豐富，其在小牛糞便中的平均豐度（1.8×102）要明顯高于其在乳牛糞便中的豐度（1.7×10-1）；Qian 等[22]在雞、豬和牛的大型養(yǎng)殖場糞便樣品中共檢測到109 種ARGs，且雞場和豬場ARGs 污染水平顯著高于牛場；Kong 等[23]調(diào)查我國吉林省羊場養(yǎng)殖糞便中ARGs 污染特征，利用高通量PCR 技術(shù)檢測到多種抗生素抗性，包括氨基糖苷類[aacC（6）I1、aacC2、aacC4、strA 和strB）、β-內(nèi)酰胺類（blaCTX-M、blaSHV和blaTEM）、四環(huán)素類（tetB、tetC、tetE、tetO 和tetQ）、大環(huán)內(nèi)酯-林酰胺類-鏈脲類（mphA、mphB、ermA、ermB 和ermC）、磺胺類（sulⅠ和sulⅡ）、喹諾酮類（qnrA 和qnrS）、多黏菌素（MCR-1）和新德里金屬-β-內(nèi)酰胺抗性（NDM-1）等，相對豐度為8.99×10-9～3.00×10-1；Liu 等[24]甚至在5 年不使用抗生素的養(yǎng)雞場糞便也檢測到超過80 種的ARGs，其中aadA、aadA1、aadA2、strB、tetM、tetK 和tetX 的基因豐度均超過10-3，cphA基因豐度高達(dá)10-1。最近，谷艷茹等[25]調(diào)查天津市家庭農(nóng)場糞污ARGs 賦存特征，發(fā)現(xiàn)tetO、tetQ、tetW 和ermB 含量最為豐富，同時檢出到blaOXA-1、blaTEM-1和blaampC等β-內(nèi)酰胺類抗性基因，這些畜禽糞肥的施用可顯著增加土壤環(huán)境中ARGs 的豐度（約8～18倍）。國內(nèi)外研究重點(diǎn)集中在畜禽養(yǎng)殖場糞便和周邊環(huán)境的ARGs 來源和污染程度解析，但有關(guān)不同規(guī)?；B(yǎng)殖場的ARGs 污染特征差異還未見報道。

環(huán)境中ARGs 主要通過接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化3 種方式進(jìn)行橫向遷移[26-31]。研究表明，有機(jī)化合物可通過調(diào)控可動遺傳因子、引起細(xì)胞SOS 反應(yīng)、脅迫細(xì)胞形成自然感受態(tài)、影響生物膜形成、改變細(xì)胞膜通透性、與胞外質(zhì)粒形成加合物等方式，影響ARGs 在微生物之間的水平轉(zhuǎn)移效率；還可通過影響微生物群落結(jié)構(gòu)，改變ARGs 的表達(dá)水平。例如，Kang 等[32]發(fā)現(xiàn)多環(huán)芳烴（菲、萘等）可通過與pUC19質(zhì)粒形成非共價鍵復(fù)合物，顯著抑制氨芐青霉素抗性基因（Ampr）的轉(zhuǎn)化效率；劉璐[33]發(fā)現(xiàn)水體中溶解性有機(jī)質(zhì)腐植酸和富里酸都對sul的增殖和傳播具有明顯的抑制效果，并且隨著濃度的升高抑制作用逐漸增強(qiáng)；Zhao等[34]發(fā)現(xiàn)腐植酸（25 mg·L-1）可影響水處理系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)，并顯著抑制四環(huán)素抗性基因（tetC、tetG、tetW和tetX）和Ⅰ類整合子基因（intI）的表達(dá)水平；Zhou等[35]研究我國華東地區(qū)高污染城市河流內(nèi)ARGs污染特征，發(fā)現(xiàn)總ARGs 的絕對豐度與總有機(jī)碳和總?cè)芙庑杂袡C(jī)氮含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。上述研究均表明有機(jī)質(zhì)的含量和成分可一定程度上影響環(huán)境介質(zhì)中ARGs 的污染水平。然而，相比于其他影響因子（如pH、溫度和抗生素）的大量報道[36-38]，畜禽養(yǎng)殖糞便中殘留有機(jī)質(zhì)含量與ARGs污染的關(guān)系還不清楚。

華北地區(qū)（京津冀）作為我國重要的工業(yè)基地，其土壤微生物環(huán)境和食品安全一直都是被關(guān)注的重點(diǎn)。本實(shí)驗選取天津和河北兩地區(qū)規(guī)?；酿B(yǎng)雞場和養(yǎng)豬場為研究對象，探討不同規(guī)模（大型、中型和小型）的養(yǎng)殖場畜禽糞便中ARGs（四環(huán)素類tet、磺胺類sul、大環(huán)內(nèi)酯類erm和喹諾酮類qns）的污染特征；測定糞便中殘留有機(jī)碳（Organic carbon，OC）和有機(jī)氮（Organic carbon，ON）的含量，分析畜禽糞便中殘留有機(jī)質(zhì)含量與ARGs 污染水平的相關(guān)性，以期為控制我國規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖場中抗生素和ARGs 污染與保障土壤環(huán)境健康提供科學(xué)依據(jù)，為環(huán)境生態(tài)風(fēng)險評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集、運(yùn)輸與保存

選取具有一定規(guī)模的養(yǎng)豬場和養(yǎng)雞場作為研究對象，采樣點(diǎn)主要分布在天津市西青區(qū)和河北省石家莊市及周邊地區(qū)，具體采樣點(diǎn)分布見圖1。以動物的年出欄量將養(yǎng)殖場規(guī)模劃分為大型、中型和小型。養(yǎng)雞場年出欄5 萬羽以上為中型養(yǎng)雞場（MC，HC1～HC4、TC1～TC2），年出欄1 萬到5 萬羽為小型養(yǎng)雞場（SC，TC3～TC4）；養(yǎng)豬場年出欄10 000 頭以上為大型養(yǎng)豬場（LS，HS1～HS2、TS1～TS2），5 000～10 000頭為中型養(yǎng)豬場（MS，HS3～HS4、TS3～TS4），5 000 頭以下為小型養(yǎng)豬場（SS，HS5～HS6、TS5～TS6）。采樣前對選取的養(yǎng)殖場養(yǎng)殖年限和抗生素使用情況進(jìn)行調(diào)研。中型和大型養(yǎng)殖場養(yǎng)殖年限均在8 年以上，小型養(yǎng)殖場養(yǎng)殖年限在3 年左右。養(yǎng)雞場常用藥物包括磺胺類（磺胺嘧啶和磺胺甲惡唑）、四環(huán)素類（四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（吉他霉素）、氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星和諾氟沙星）和氨基糖苷類（慶大霉素和卡那霉素）；養(yǎng)豬場常用藥物包括磺胺類（磺胺甲嘧啶和磺胺甲惡唑）、四環(huán)素類（四環(huán)素、金霉素和土霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（泰樂菌素）和氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星和恩諾沙星）。采樣時利用鏟子收集豬舍和雞舍新鮮出欄未經(jīng)任何處理的糞便，每個養(yǎng)殖場隨機(jī)選取3 個不同的養(yǎng)殖欄收集一定量糞便，然后迅速攪拌混合均勻作為均一樣品。糞便收集完畢后立即低溫快遞運(yùn)回實(shí)驗室，提取DNA之前-20 ℃保存。

圖1 養(yǎng)殖場采樣點(diǎn)分布Figure 1 The locations of targeted livestock farms

1.2 主要試劑與耗材

糞便基因組DNA 提取試劑盒FastDNA?SPIN Kit for Feces 購買自美國MP Biomedicals 生物醫(yī)藥公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（DP208/209）購買自北京天根生化科技有限公司；異丙醇、乙醇、EDTA、Na2EDTA、瓊脂粉、Loading Buffer、溴化乙錠（EB）、NaCl、Tris、IPTG、X-gal、氨芐青霉素、瓊脂糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、E.coli感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T Simple Vector、2×Taq PCR Green Mix 等試劑均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒則由TAKARA提供。實(shí)驗用水均為雙蒸水。

1.3 基因組DNA的提取與PCR反應(yīng)

糞便細(xì)菌基因組DNA 的提取依照FastDNA?SPIN Kit for Feces 試劑盒指示操作進(jìn)行。DNA 提取后，使用微量核酸蛋白測定儀（Nanodrop2000）鑒定核酸濃度及純度，保證OD260/OD280比值大于1.8，以滿足后續(xù)PCR 實(shí)驗要求。然后以基因組DNA 為模板，經(jīng)稀釋后混合為25 μL PCR 反應(yīng)體系，PCR 反應(yīng)體系為：12.5 μL 的2×Taq PCR Green Mix（包含0.1 U·μL-1Taq DNA Polymerase、2×PCR buffer、3 mmol·L-1MgCl2和0.4 mmol·L-1dNTPs）、前端引物0.5 μL（10 mmol·L-1）、后端引物0.5 μL（10 mmol·L-1）、DNA 模板1 μL和10.5 μL 的雙蒸水，空白對照組以雙蒸水為模板。檢測目標(biāo)基因包含tet類[tetA、tetC、tetG、tetH、tetL、tetM、tetO、tetW、tetT、tetX 和tet（B/P）]、sul類（sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ）、erm類（ermB 和ermC）和qns類（oqxB、qepA、qnrD和qnrS）抗性基因，基因引物序列詳情如表1 所示。定性PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3～5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s后，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，利用DNA 凝膠電泳檢測所得條帶，統(tǒng)計目標(biāo)基因的檢出率。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）

選擇糞便樣品中檢出率為100%的目標(biāo)基因，鑒定ARGs 的相對豐度。本實(shí)驗中ARGs 的定量采用絕對定量法，選取16S rRNA 作為內(nèi)參基因。首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：目的基因普通PCR 后，條帶切膠回收，目的基因片段與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物與50 μL解凍后的E.coli感受態(tài)細(xì)胞均勻混合，用未加入氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)培養(yǎng)。然后將菌液均勻地涂在含有氨芐青霉素、X-gal 和IPTG 的LB 固體抗性平板上培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選挑選出白色重組菌斑，挑選出的白色菌斑在LB液體培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)后取出抽提質(zhì)粒，利用Nanodrop2000 鑒定所提質(zhì)粒DNA 的濃度及純度，換算出質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品的基因拷貝數(shù)，然后將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒梯度稀釋，使其濃度在10-7～10-1，經(jīng)RT-qPCR 擴(kuò)增后作出Ct 值與DNA 起始濃度有關(guān)的線性曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制得到目標(biāo)基因的擴(kuò)增曲線公式，目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率E 在84.8%～133.9%，相關(guān)系數(shù)R2基本都保持在0.99 以上，線性關(guān)系良好。

表1 PCR引物序列Table 1 The sequence of PCR primers

RT-qPCR 反應(yīng)體系為：12.5 μL TransStart?Top Green qPCR SuperMix、正向和反向引物（10 mmol·L-1）各0.5 μL、DNA 模板1 μL 和雙蒸水10.5 μL。具體反應(yīng)程序為：94 ℃下預(yù)變性5 s，95 ℃變形30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，總共40 個循環(huán)，溶解曲線程序在55～95 ℃，每隔0.5 s 讀數(shù)，每個溫度停留30 s。程序結(jié)束后記錄其循環(huán)數(shù)（Ct值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出起始樣品中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，以16S rRNA 基因校準(zhǔn)，計算得出目標(biāo)基因在畜禽糞便樣品中的相對豐度。

1.5 有機(jī)碳和有機(jī)氮測定

實(shí)驗采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法（HJ 615—2011）測定糞便樣品中的有機(jī)碳（OC）含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)使用液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取0.5～1 g 干燥后的糞便樣品加入到消解玻璃管中，每個樣品做3 個平行，然后加入0.5 g 硫酸汞和10 mL 重鉻酸鉀溶液，搖勻后緩慢加入7.5 mL 濃硫酸，恒定溫度135 ℃加熱30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入約50 mL 水冷卻至室溫，倒入比色管中加水至100 mL，搖勻，靜置2 h后取30 mL溶液，2 000 r·min-1離心10 min，靜置澄清，收集上清液，在585 nm 處以水為參比測定溶液吸光度。干燥糞便樣品中的OC 含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%）按照如下公式進(jìn)行計算：

式中：Woc為樣品中OC的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），mg C·g-1；m1為風(fēng)干樣品質(zhì)量，g；A為消解液的吸光度；A0為空白組的吸光度；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

有機(jī)氮（ON）含量由凱氏氮和銨態(tài)氮含量差減法計算得出。凱氏氮含量采用全自動凱氏定氮儀（KJELTECTM8400，F(xiàn)OSS，丹麥）測定，銨態(tài)氮含量則采用納氏試劑比色法（HJ 535—2009）測定。稱取干燥糞便樣品5 g 置于錐形瓶中，加入0.05 mol·L-1的鹽酸30 mL，振蕩混勻30 min 后取出倒入離心管中3 000 r·min-1離心10 min，靜置澄清后取上清液5 mL置于容量瓶中定容至100 mL，而后取稀釋液2 mL 置于50 mL 的比色管中，加水至50 mL，然后分別加入1.5 mL 的納氏試劑和1 mL 的酒石酸鉀鈉溶液混勻，在波長420 nm處以水為參比測定吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

文中所列數(shù)據(jù)為3 個平行組的平均值，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和繪制利用IBM SPSS Stastistic 20.0和Origin 9.0軟件，顯著性使用獨(dú)立樣本t 檢驗進(jìn)行分析，P＜0.05 表示具有顯著性差異。利用SIMCA-P 11.5 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，使用正交偏最小二乘判別（OPLS-DA）方法，VIP（Variable important in projection）是OPLS-DA 模型變量的變量權(quán)重值，表示有機(jī)質(zhì)對不同種類ARGs 的影響強(qiáng)度和解釋能力，VIP≥1 表示具有顯著性。利用Canoco 5.0 軟件進(jìn)行典型相關(guān)分析（CCA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 規(guī)?；B(yǎng)殖場糞便中ARGs的檢出頻率

養(yǎng)殖場采集畜禽糞便樣品中ARGs 的檢出頻率如表2 所示。實(shí)驗結(jié)果顯示，編碼外排泵蛋白（Efflux pump proteins，EPP）的tetH 和tetL、編碼核糖體保護(hù)蛋白（Ribosomal protection proteins，RPP）的tetM、tetO 和tetW、以及編碼酶抑制劑（Enzyme-inhibitor complex，EI）的tetX 的檢出率均達(dá)到100%；對sul基因而言，sulⅠ和sulⅡ在所有樣品中均有檢出，sulⅢ的檢出頻率則相對較低（85%）；兩種erm基因在所有養(yǎng)殖場中均檢測到；所有qns基因的檢出率在80%～95%之間，相比于tet、sul和erm基因，檢出率明顯偏低。

表2 養(yǎng)殖場畜禽糞便中ARGs的檢出頻率（n=20）Table 2 The detection frequencies of the targeted ARGs in livestock manures（n=20）

2.2 規(guī)?；B(yǎng)殖場糞便樣品中ARGs污染特征

2.2.1 不同畜禽種類養(yǎng)殖場糞便樣品中ARGs 的相對豐度

河北和天津地區(qū)不同規(guī)模的養(yǎng)豬場和養(yǎng)雞場ARGs相對豐度分別如圖2和圖3所示，結(jié)果表明不同種類養(yǎng)殖場糞便中ARGs 的污染特征存在顯著差異。在豬糞便中，tetM，tetO 和tetW 總體相對豐度是最高的（4.24×10-3～5.85×10-1），erm基因次之（6.36×10-4～6.45×10-2），sul基因的相對豐度最低（1.07×10-4～5.56×10-2），這種趨勢在河北地區(qū)尤為明顯。而在雞糞樣品中，ARGs 整體豐度較高，不同抗生素的ARGs 相對豐度相差較小，erm基因（2.51×10-2～2.62×10-1）、sul基因（1.86×10-3～2.26×10-1）與編碼RPP 的tet基因（1.13×10-2～2.59×10-1）的相對豐度較為接近，均高于編碼EPP（1.31×10-4～1.84×10-2）和EI（8.97×10-4～4.25×10-3）的tet基因相對豐度。

養(yǎng)雞場糞便中sul和erm基因的相對豐度高于其在養(yǎng)豬場糞便中的相對豐度。例如，河北省雞糞中sulⅡ基因的相對豐度為2.16×10-2～2.26×10-1，而其在豬糞中的相對豐度則為1.2×10-4～5.56×10-2，研究結(jié)果與Cheng 等[50]調(diào)研我國華東地區(qū)畜禽糞便的結(jié)論一致。對于畜禽養(yǎng)殖業(yè)ARGs 污染水平而言，抗生素使用量越高，糞便中殘留的抗生素含量越高，ARGs的污染就越嚴(yán)重。Zhao等[51]研究報道指出，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)雞糞中抗生素殘留量（1 420.76 mg·g-1）明顯高于豬糞。更高含量的抗生素殘留量和更嚴(yán)重的選擇性壓力，導(dǎo)致雞糞中sul和erm基因的污染水平比豬糞中的更高。意外的是，編碼RPP 和EPP 抗性的tet基因在豬糞和雞糞中的相對豐度較為接近，這可能與這兩類ARGs 廣泛的宿主菌群和高水平轉(zhuǎn)移擴(kuò)散能力有關(guān)[52]。

圖2 河北地區(qū)養(yǎng)殖場畜禽糞便ARGs的相對豐度Figure 2 The relative abundances of ARGs in manures collected from livestock farms in Hebei Province

ARGs 污染水平與其宿主菌的種類、數(shù)量以及微生物種屬之間的轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。大多數(shù)tet基因坐落于非移動性基因元件上[52]，但是編碼RPP 抗性的tet基因仍然具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，可通過氧四環(huán)素抗性質(zhì)粒進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移傳播[53]；而且相對于編碼EPP 和EI抗性的tet基因，tetM、tetO 和tetW 具有更廣泛的宿主菌（分別為60、24種和12種），導(dǎo)致糞便和環(huán)境介質(zhì)中編碼RPP 抗性的tet基因相對豐度普遍更高[54]。同樣地，實(shí)驗發(fā)現(xiàn)不同抗性機(jī)理的tet基因相對豐度趨勢為：RPP＞EPP＞EI，tetM、tetO 和tetW 的最高相對豐度分別可達(dá)1.96×10-1、2.59×10-1和5.85×10-1。此外，大部分erm基因同時編碼有大環(huán)內(nèi)酯（Macrolide）、林酰胺類（Lincosamide）和鏈脲類（Streptogramin）抗性（MLS），可輕易被移動質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子獲得并隨之水平接合轉(zhuǎn)移，在環(huán)境介質(zhì)中污染水平也普遍較高[55-56]，實(shí)驗同樣發(fā)現(xiàn)其相對豐度顯著高于編碼EPP 和EI 的tet基因。對于sul基因，sulⅠ和sulⅡ都編碼DHPS 抗性，且sulⅠ基因多數(shù)位于Ⅰ類整合子移動基因元件上[57]，大量研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境介質(zhì)（土壤、水體和污泥等）中sulⅠ基因的相對豐度普遍高于sulⅡ基因[58]，但是sulⅡ基因污染水平更易受到人為活動因素干擾[59]，這可能是本研究發(fā)現(xiàn)畜禽糞便sulⅡ基因相對豐度高于sulⅠ基因的主要原因。重要的是，sulⅡ基因的檢測豐度最高可達(dá)2.26×10-1，明顯高于Munir 等[60]和Ji等[61]研究動物糞便中檢測到的sulⅡ基因豐度，說明近些年隨著抗生素的進(jìn)一步使用，畜禽養(yǎng)殖業(yè)中ARGs的污染水平變得更加嚴(yán)重和不可忽視。

圖3 天津地區(qū)養(yǎng)殖場畜禽糞便ARGs的相對豐度Figure 3 The relative abundances of ARGs in manures collected from livestock farms in Tianjin

2.2.2 不同地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場糞便樣品中ARGs 的相對豐度

四環(huán)素類和磺胺類是畜禽養(yǎng)殖業(yè)使用最為頻繁的抗病藥物，tet和sul兩類抗性基因的檢出也極為頻繁。Heuer 等[62]2008 年調(diào)查發(fā)現(xiàn)德國養(yǎng)豬場糞便中sul基因相對豐度的數(shù)量級保持在10-5～10-2；2009 年檢測美國24個畜禽養(yǎng)殖場糞便中ARGs污染水平，結(jié)果顯示tetW 和sulⅠ基因的相對豐度分別在10-3～10-2和10-6～10-5[63]；2014 年Garder 等[64]研究表明erm基因在畜禽糞便樣品中難以檢測到，但是在排放糞便的周邊土壤和水體環(huán)境中則檢出頻率較高。上述研究表明，不同地區(qū)畜禽養(yǎng)殖業(yè)ARGs 的污染水平存在較大差異。在本項研究中，河北地區(qū)養(yǎng)豬場和養(yǎng)雞場ARGs 的平均相對豐度分別為4.99×10-2和1.36×10-1，均高于天津市養(yǎng)豬場和養(yǎng)雞場ARGs 的平均相對豐度（分別為1.89×10-2和4.45×10-2），尤其是中型養(yǎng)豬場（P=0.023），表明河北地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場糞便ARGs 污染水平要比天津市更為嚴(yán)重，這可能與當(dāng)?shù)夭煌?guī)模的畜禽養(yǎng)殖場抗生素管控政策和措施有關(guān)。然而，受限于天津市未采集到中型養(yǎng)雞場糞便樣品和抗生素使用量的不確定，不同地區(qū)養(yǎng)殖企業(yè)ARGs 污染水平差異的具體原因仍需進(jìn)一步核查。

2.2.3 不同規(guī)模的畜禽養(yǎng)殖場糞便中ARGs 的相對豐度

圖4和表3結(jié)果顯示，河北地區(qū)小型、中型和大型養(yǎng)豬場糞便ARGs的平均相對豐度為1.62×10-2、6.76×10-2和6.60×10-2，中型養(yǎng)豬場平均ARGs 相對豐度最高，顯著高于小型養(yǎng)豬場（P=0.018），而中型與大型養(yǎng)豬場、大型與小型養(yǎng)豬場之間均無顯著性差異；天津地區(qū)小型、中型和大型養(yǎng)豬場糞便ARGs 的平均相對豐度為6.8×10-3、3.12×10-2和1.87×10-2，與河北地區(qū)類似，天津中型規(guī)模養(yǎng)豬場糞便ARGs 豐度顯著高于小型養(yǎng)豬場（P=0.039），其他不同規(guī)模養(yǎng)豬場之間ARGs污染水平無顯著性差異。不同規(guī)模養(yǎng)豬場糞便中ARGs 的平均相對豐度趨勢均為：中型＞大型＞小型，說明中等規(guī)模的養(yǎng)豬場對抗生素的使用更為泛濫，小型養(yǎng)豬場抗生素使用則相對較少。

河北地區(qū)中型養(yǎng)雞場糞便ARGs 的平均相對豐度為1.36×10-1，天津市中型和小型養(yǎng)雞場糞便ARGs的平均相對豐度分別為5.37×10-2和3.53×10-2，相對于相同地區(qū)同等規(guī)模的養(yǎng)豬場而言，養(yǎng)雞場糞便中ARGs相對豐度明顯更高；此外，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示天津市小型和中型養(yǎng)雞場之間ARGs 污染水平無顯著性差異（P=0.551）。上述研究結(jié)果表明，同一地區(qū)雞類養(yǎng)殖企業(yè)對抗生素的使用相比于養(yǎng)豬場可能更為嚴(yán)重，養(yǎng)雞場無論規(guī)模大小，糞便中ARGs 的污染水平普遍較高。

圖4 不同規(guī)模畜禽養(yǎng)殖場糞便中ARGs的相對豐度Figure 4 The relative abundance of ARGs in animal manures collected from different scaled livestock farms

表3 河北和天津地區(qū)不同規(guī)模養(yǎng)殖場糞便中ARGs豐度差異性顯著水平（P）Table 3 The statistical significance（P value）of ARGs abundances in different scaled livestock farms in Hebei Province and Tianjin

2.3 畜禽糞便中有機(jī)質(zhì)與ARGs污染水平的相關(guān)性分析

養(yǎng)殖場畜禽糞便中OC 和ON 的檢測含量如表4所示，除HC4 外所有糞便樣品中OC/ON 比值均超過8。OPLS-DA 相關(guān)性分析（圖5）結(jié)果表明，豬糞中ARGs 相對豐度與OC 含量的相關(guān)性比雞糞要強(qiáng)，顯著相關(guān)的基因種類更多（sulⅠ、ermC、tetL、tetM、tetW和tetX），而ARGs 豐度與ON 和OC/ON 的相關(guān)性在豬糞和雞糞中則比較接近。此外，不同種類的ARGs 與有機(jī)質(zhì)含量的相關(guān)性有差異。tet基因與OC 和ON 的相關(guān)性要明顯強(qiáng)于sul和erm基因，其中編碼RPP 的tet基因與有機(jī)質(zhì)的相關(guān)性最強(qiáng)，例如豬糞樣品中tetM與OC和OC/ON均顯著正相關(guān)，tetO與ON和OC/ON均顯著相關(guān)，tetW 則與OC 和ON 均顯著正相關(guān)；在雞糞樣品中，tetM 和tetW 基因則均與ON 含量和OC/ON 顯著相關(guān)。

已有研究表明，生物可利用碳氮比（C/N）影響著微生物的群落結(jié)構(gòu)及其活性[65]，而微生物群落結(jié)構(gòu)與ARGs 的豐度和多樣性緊密相關(guān)[66]。研究發(fā)現(xiàn)，雞糞樣品中sulⅠ和sulⅡ基因均與OC/ON 呈顯著負(fù)相關(guān)，而在豬糞中則呈正相關(guān)；對于tet基因，tetH 基因和編碼RPP 的tet基因相對豐度幾乎均與OC/ON 呈顯著性相關(guān)。上述研究結(jié)果表明畜禽糞便中OC/ON 可能是決定ARGs 污染水平的重要因素之一。研究結(jié)果還顯示ARGs 的相對豐度與OC/ON 之間的相關(guān)性和其與ON 之間的相關(guān)性幾乎完全相反，尤其是顯著性相關(guān)的基因（sulⅡ、ermC、tetH、tetM、tetO 和tetW），表明畜禽養(yǎng)殖場糞便中ON 含量與ARGs 污染水平有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

畜禽糞便中ARGs 污染水平受到多種因子的影響。本研究發(fā)現(xiàn)糞便中有機(jī)質(zhì)（尤其是ON）含量與多種ARGs 污染水平呈現(xiàn)顯著性相關(guān)，表明有機(jī)質(zhì)成分和含量可能是調(diào)控糞便ARGs 賦存特征和水平的重要因素。研究表明，可生物利用的OC 和ON 等營養(yǎng)物質(zhì)決定著微生物胞外酶活性和細(xì)胞外基質(zhì)的組分和功能[67]，這些胞外酶和胞外基質(zhì)可通過吸附和水解等作用影響外來分子（包括DNA）轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的效率和能力。Tets 等[68]發(fā)現(xiàn)在生物膜中，胞外的蛋白水解酶可顯著抑制抗性質(zhì)粒的接合頻率。這些研究結(jié)果預(yù)示著有機(jī)質(zhì)可能通過影響細(xì)菌胞外分泌物的成分和活性，從而影響ARGs 在腸道微生物之間的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。此外，Hu 等[69]發(fā)現(xiàn)糞便中OC/ON 比值高于8 時，反硝化細(xì)菌會成為主要的優(yōu)勢菌群，在一定范圍內(nèi)，ON 含量越高和有效C/N 越大，反硝化效率會增高，反硝化細(xì)菌越容易占據(jù)優(yōu)勢主導(dǎo)地位；任四偉[70]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)雞場和養(yǎng)豬場糞便中的單一（62.58%～89.43%和29.62%～49.72%）和多重抗生素類群（95.29%和88.55%）主要是擬桿菌門（Bacteroide?tes）；蔣志云等[71]采用Miseq 高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在污水處理反硝化過程中，優(yōu)勢微生物菌群始終以變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主。綜合上述研究結(jié)果，有機(jī)質(zhì)（OC 和ON）可能通過調(diào)控畜禽糞便中的優(yōu)勢抗性菌群及其胞外分泌物的成分和活性，影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞便中ARGs的污染水平。

CCA分析結(jié)果（圖6）表明：sul基因與OC/ON顯著相關(guān)，tetM、tetO 和tetW 均具有豐富的宿主菌群[28]，更容易受到有機(jī)質(zhì)含量的影響，與OC 和ON 均表現(xiàn)出非常強(qiáng)的相關(guān)性，這與OPLS-DA 相關(guān)性分析的結(jié)果是一致的。相比之下，erm基因和tetX 基因與有機(jī)質(zhì)含量的相關(guān)性很弱。眾多研究表明erm基因和編碼EI的tet基因在養(yǎng)殖業(yè)糞便和周邊土壤環(huán)境中普遍存在且豐度較高[72-73]，表明畜禽養(yǎng)殖業(yè)ARGs 污染水平的環(huán)境影響因子仍需進(jìn)一步探索和研究。

表4 天津和河北地區(qū)養(yǎng)殖場畜禽糞便中有機(jī)碳和有機(jī)氮含量Table 4 The contents of organic carbon and organic nitrogen in collected manures in Tianjin and Hebei Province

圖6 畜禽糞便中ARGs豐度與有機(jī)質(zhì)含量的典型對應(yīng)分析Figure 6 Canonical correspondence analysis of ARGs abundance and the contents of organic matter in livestock manures

3 結(jié)論

（1）華北地區(qū)養(yǎng)雞場糞便中sul和erm基因的相對豐度顯著高于其在豬糞中的水平，編碼RPP 的tet基因（10-2～10-1）在兩種畜禽糞便中的相對豐度比較接近，高于sul（10-4～10-1）、erm（10-3～10-1）、編碼EPP和編碼EI的tet基因（10-5～10-2）的相對豐度。

（2）不同規(guī)模養(yǎng)豬場糞便中ARGs 污染水平趨勢為：中型＞大型＞小型，不同規(guī)模的養(yǎng)雞場ARGs 的平均相對豐度無顯著差異。

（3）養(yǎng)殖糞便中ARGs 污染水平與有機(jī)質(zhì)含量高度相關(guān)。tetM、tetO 和tetW 基因與有機(jī)碳（OC）和有機(jī)氮（ON）含量高度相關(guān)（VIP＞1），sul基因則與OC/ON呈明顯的相關(guān)性，ON 和生物可利用C/N 是影響畜禽養(yǎng)殖糞便ARGs污染水平的重要因素。

圖5 畜禽糞便中ARGs相對豐度與有機(jī)質(zhì)含量OPLS-DA相關(guān)分析的變量權(quán)重（VIP）值Figure 5 The statistical VIP value of OPLS-DA analysis between ARGs abundance and organic matter in livestock manures