pH值和溫度對燕麥蛋白溶解與聚集特性的影響

高曉莉 王麗麗 劉麗婭 佟立濤 周閑容 周素梅

(中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

燕麥(AvenasativaL.)在我國北方又稱莜麥，屬禾本科農(nóng)作物，分為裸燕麥和皮燕麥。燕麥不僅富含蛋白質、碳水化合物、脂質等營養(yǎng)成分，而且富含β-葡聚糖、不飽和脂肪酸、酚酸等功能性成分[1]，具有預防心血管疾病、降低膽固醇、平穩(wěn)血糖[2]、幫助胃腸消化[3-4]、抗癌[5-6]等功效。燕麥的蛋白質含量居糧谷類作物首位，研究表明，受產(chǎn)地、品種等因素的影響，燕麥中的蛋白質含量在12%～20%之間，平均值達到16%左右[7]。燕麥蛋白被公認為是氨基酸配比全面且合理的谷物蛋白[8]，其賴氨酸的含量更接近聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)/世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦標準[9]。

按照Osborne蛋白分類方法可將燕麥蛋白分為球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中球蛋白作為貯藏蛋白含量最高(55%～75%)[10]。燕麥蛋白的理化性質和某些豆科植物的11S貯藏蛋白相似[11]，后者已被作為食品添加劑廣泛用于食品工業(yè)，但燕麥在加工過程中，由于溫度、pH值的變化，其蛋白的結構和構象會發(fā)生改變，導致其功能特性會受到一定影響，限制了其在食品工業(yè)中的作用。

蛋白質在受熱時都有發(fā)生聚集的趨勢，但是蛋白聚集機理卻隨其種類而異。對于具有復雜四級結構的寡聚蛋白而言，加熱會引起寡聚體的聯(lián)結或分離，同時蛋白分子四級結構本身的破壞也會導致聚集發(fā)生。Zhao等[12]利用排阻色譜和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)研究了燕麥球蛋白的熱凝固現(xiàn)象，結果表明,加熱過程中燕麥球蛋白在分解成小亞基的同時也交聯(lián)形成了大分子量的聚集體。依據(jù)蛋白結構展開和聚集體尺寸不同，熱處理在不同程度上可影響蛋白的聚集和溶解特性。蛋白質的溶解性與其功能特性(如乳化性、起泡性、凝膠性)密切相關，是蛋白變性程度的一個重要表征。蛋白質的溶解性取決于蛋白分子表面親水基團與疏水基團的相互作用以及表面電荷數(shù)。當pH值接近蛋白質的等電點時，電荷的靜電屏蔽導致蛋白質分子的靜電斥力減小[13]，分子之間的吸引力(主要是通過疏水相互作用的吸引)增大，致使蛋白分子發(fā)生聚集[14]。pH值的變化導致可溶性或不可溶性聚集體形成，而不溶性聚集體正是影響蛋白質在水相體系中溶解性以及穩(wěn)定性的主要成分。

本研究以燕麥蛋白為研究對象，考察不同pH值條件下燕麥蛋白溶解性與表面電荷的變化；通過分析燕麥蛋白粒徑分布與乳化性的變化，進一步揭示pH值對燕麥蛋白聚集特性與乳化特性的關系以及對其穩(wěn)定性的影響。同時，分析了不同溫度處理條件下燕麥蛋白溶解度、表面電荷和聚集體粒徑的變化趨勢，進而揭示溫度處理對燕麥蛋白溶解特性以及聚集特性變化的影響機制，以期為燕麥蛋白資源的利用提供重要的指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥：白燕2號，由吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學院提供；佳格(中國)葵花籽油，佳格食品(北京)有限公司；其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純，國藥集團化學試劑有限公司。BCA試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Kieltec Analysister全自動凱氏定氮儀，瑞典FOSS儀器有限公司；FW100萬能粉碎機，科偉永興(北京)儀器公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Scientz-10N凍干機，寧波新芝生物科技有限公司；DHG-9 240A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；Zeta電位及納米粒度分析儀，英國馬爾文公司；S3500SI激光粒度粒形分析儀，美國Microtrac公司；TU-1900紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器公司；PB-20 pH計，德國賽多利斯股份公司；APV-2000均質機，德國SPX公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 燕麥蛋白制備 采用堿溶酸沉法提取燕麥蛋白，參照Liu等[15]的方法，并進行適當修改。燕麥籽粒經(jīng)挑選除雜后，采用萬能粉碎機制粉，過80目篩，收集篩下物為燕麥粉樣品，4℃保存，備用。

準確稱取燕麥粉200 g，按照1∶6(m∶m)的料液比添加去離子水，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)體系pH值至9.0，磁力攪拌器攪拌2 h。7 000×g、4℃離心20 min，留上清液。用1 mol·L-1HCl溶液調(diào)上清液pH值至4.5，4℃靜置過夜，7 000×g、4℃離心20 min，留沉淀，制得燕麥蛋白樣品，備用。

1.3.2 燕麥蛋白純度測定 采用凱氏定氮法[1]測量1 g燕麥蛋白樣品中的蛋白含量，燕麥蛋白換算系數(shù)為6.25。

企業(yè)與經(jīng)濟環(huán)境的和諧主要涉及下列內(nèi)容：經(jīng)濟發(fā)展是高速發(fā)展、中速發(fā)展、低速發(fā)展，還是處于停滯、倒退時期，甚至發(fā)生經(jīng)濟危機等；國家支持哪些產(chǎn)業(yè)發(fā)展；國家的支柱產(chǎn)業(yè)、經(jīng)濟政策、金融管理體制等等。企業(yè)要抓住國家經(jīng)濟政策，大力發(fā)展自己，做大做強，實現(xiàn)穩(wěn)步發(fā)展，達到基業(yè)長青。

1.3.3 pH值對燕麥蛋白特性的影響試驗 分別取100 mg燕麥蛋白樣品分散于10 mL去離子水，磁力攪拌器攪拌30 min，然后用1 mol·L-1NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10，在500 r·min-1條件下攪拌1 h后觀察pH值變化，如有變化再調(diào)回。隨后進行乳化性、溶解度、ζ-電位和粒徑分析。每個處理設2個平行，試驗重復3次。

1.3.4 溫度對燕麥蛋白特性的影響試驗 分別取100 mg燕麥蛋白樣品分散于10 mL去離子水，磁力攪拌30 min，然后用1 mol·L-1NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為7，在500 r·min-1條件下攪拌1 h，充分水化后的樣品分別置于常溫(25℃)、55、75、95、121[工業(yè)中殺菌溫度UHT(ultra - high temperature instantaneous sterilization))]和130℃(油浴)中保持10 min。迅速降溫冷卻。隨后進行溶解度、ζ-電位和粒徑分析。每個處理設2個平行，試驗重復3次。

1.3.5 乳化性測定 取15 mL蛋白溶液與5 mL葵花籽油混合，置于50 mL玻璃試管中。在高速乳化均質機下13 500 r·min-1乳化2 min，將乳化液迅速倒入小燒杯中，立即取樣。取樣點固定在離燒杯底部0.5 cm處，取20 μL乳狀液與5 mL 0.1% SDS溶液均勻混合，在500 nm波長處測定其吸光度值(A0)，乳狀液靜置30 min后，采用相同的方法測定乳狀液吸光度值(A30)，用0.1% SDS做空白對照[16]。按照公式計算乳化活性(emulsion activity index，EAI，m2·g-1)和乳化穩(wěn)定性(emulsion stability index，ESI，min)：

EAI=2T(A0×N)/(c×φ×10 000)

(1)

ESI=A0/(A0-A30)×30

(2)

式中，T=2.303；N稀釋倍數(shù)，250；c為乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質濃度，g·mL-1；φ為乳化液中油的體積分數(shù)，0.25。

1.3.6 溶解度測定 將蛋白樣品10 000×g、4℃離心20 min后取上清液，采用BCA試劑盒測定上清液中的蛋白含量[17]，以牛血清白蛋白為標準物制作標準曲線。溶解度=(上清液蛋白質量濃度/總蛋白質量濃度)×100。

1.3.7 ζ-電位分析 采用Zeta納米粒度分析儀對燕麥蛋白溶液的電位進行測定[18]。測試條件:電壓30 mW，溫度25±1℃，平衡2 min，每個樣品重復測量3次以上并取其平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3次，采用Microsoft Excel 2003軟件制圖，采用 SPSS 19.0 軟件 Duncan 檢驗法進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 pH值對燕麥蛋白溶解性的影響

本試驗驗通過凱氏定氮分析堿溶酸沉法提取的燕麥蛋白純度為86%。

由圖1可知，隨著pH值的增加，燕麥蛋白的溶解度先減小后增大；當pH值為5時，燕麥蛋白的溶解度最低。當pH遠離等電點(pH值5.0)時，燕麥蛋白的溶解度提高，當pH值為9和10時，燕麥蛋白的溶解度達到80%以上。這是由于在等電點附近，蛋白分子表面電荷含量幾乎為零，分子間的排斥力減弱，蛋白顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，溶解度降低；當溶液的pH值遠離蛋白質的等電點時，蛋白分子間的電荷數(shù)增多，分子之間的排斥力增強，致使蛋白分散，水溶性增加，從而提高其溶解性[20]。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 pH值對燕麥蛋白溶解性的影響Fig.1 Effect of pH value on the solubility of oat protein

2.2 pH值對燕麥蛋白ζ-電位值的影響

由圖2可知，當pH值從2增加至10時，ζ-電位值從正值變?yōu)樨撝?由20.5 mV變化至-23.8 mV)。當pH值為2、3、4時，燕麥蛋白所帶電荷為正值，pH值為5 左右時電位值接近于零，而pH值為6～10時，ζ-電位值為負值。尤其當pH 值為9和 10時，ζ-電位絕對值顯著增加，液滴表面帶有大量的負電荷[19]。這可能是由于當?shù)鞍兹芤簆H值低于等電點時，氨基基團帶正電荷，羧基基團呈中性，高于等電點時，氨基基團呈中性而羧基基團帶負電荷，因此，當?shù)鞍兹芤簆H值小于等電點時，帶正電的氨基基團數(shù)量大于帶負電的羧基基團總數(shù)，此時蛋白質具有凈正電荷；而當pH值大于等電點時帶電結果正好相反；當?shù)鞍兹芤簆H值位于等電點附近時，其正電荷和負電荷的總數(shù)平衡，因此蛋白質的凈電荷為零。

圖2 pH值對燕麥蛋白ζ-電位值的影響Fig.2 Effect of pH value on the ζ-potential of oat protein

2.3 pH值對燕麥蛋白粒徑分布比例的影響

由圖3可知，當pH值為5時，燕麥蛋白粒徑的分布范圍集中在40～100、100～200、200～2 000 μm，其中200～2 000 μm大粒徑占比為22.72%。這可能是由于在等電點附近蛋白質表面電荷幾乎為零，液滴之間失去了靜電斥力，蛋白質相互作用形成較大的聚集體，導致溶液粒徑較大，此時燕麥蛋白的溶解性也最差。當pH值為7時，蛋白溶液中小于40 μm的粒徑增多，溶液中仍存在200～2 000 μm的大粒徑，占比降至10.44%。pH值為10時，燕麥蛋白溶液中幾乎沒有200～2 000 μm的大粒徑顆粒，粒徑集中分布在40 μm以下、40～100 μm、100～200 μm范圍內(nèi)，其中小于100 μm粒徑燕麥蛋白的占比為98.18%。隨著pH值的增加，蛋白表面負電荷逐漸增多，因此蛋白粒子間斥力增大，溶液中蛋白粒子均勻分布在體系中，形成較為穩(wěn)定的溶液[21]。

圖3 pH值對燕麥蛋白粒徑分布比例的影響Fig.3 Effect of pH value on the percentage of oat protein with different particle size

2.4 pH值對燕麥蛋白乳化性的影響

蛋白質乳化性是指蛋白質作為乳化劑乳化穩(wěn)定乳化液的能力，主要包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性。由圖4可知，隨著pH值的增加，燕麥蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈先降低后增加的趨勢。當pH值大于8時，蛋白乳化活性的增勢趨于平穩(wěn)；在等電點范圍(pH值5.0左右)內(nèi)，燕麥蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均最差，主要是由于在等電點附近，燕麥蛋白表面電荷基本為零，分子間排斥力消失[22]，蛋白質相互作用形成較大聚集體，溶解性最差，能夠吸附在油、水界面上的蛋白質減少，形成乳狀液的能力降低，燕麥蛋白在等電點附近的乳化活性和乳化穩(wěn)定性較差。

由上述試驗結果可知，pH值通過影響蛋白溶解度的方式來影響蛋白質的乳化性。在pH值接近燕麥蛋白的等電點(pH值5.0左右)時，蛋白的表面電荷數(shù)最低，質與體系中極性基團的作用力降至最低，溶解性最低，乳化性也降至最低。當pH值遠離等電點時，燕麥蛋白的表面電荷增加，與周圍基團的作用力增強，溶解度增加，乳化性也隨之升高。

圖4 pH值對燕麥蛋白乳化性的影響Fig.4 Effect of pH value on emulsifying property of oat protein

2.5 溫度對燕麥蛋白溶解度的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，燕麥蛋白溶解度呈先升高后降低的趨勢。當溫度為95℃時，燕麥蛋白的溶解度達到最大(35.1%)。這表明，溶液中的蛋白質粒子在熱作用下先解離而后聚集。適當升高溫度，有利于蛋白質和水分子的運動以及相互作用，部分原是聚集體的蛋白開始解離，溶解于水中，因此對燕麥蛋白的溶解性起到促進作用，且在95℃時這種解離作用達到最大，體系中蛋白質的溶解度也相應達到最大；但當達到燕麥蛋白的變性溫度(100℃左右)時，部分蛋白質變性或解離的蛋白粒子發(fā)生重新聚集，導致蛋白質溶解度降低[23]。

圖5 溫度對燕麥蛋白溶解度的影響Fig.5 Effect of temperature on the solubility of oat protein

2.6 溫度對燕麥蛋白電位值的影響

燕麥蛋白在pH值7.0時帶負電荷，其溶液的ζ-電位值在未加熱(25℃)時為-10.5 mV， 隨著溫度的升高，ζ-電位絕對值增大，溫度為95℃時燕麥蛋白溶液的電位絕對值最大，18.4 mV(圖6)。這是由于熱處理導致燕麥蛋白結構更大程度的展開，暴露出更多的帶電基團[19]；121和130℃熱處理蛋白ζ-電位值絕對值下降，此時液滴之間的斥力勢能較小，燕麥蛋白聚集程度增加，穩(wěn)定性變差。

圖6 溫度對燕麥蛋白電位值的影響Fig.6 Effect of temperature on the ζ-potential of oat protein

2.7 溫度對燕麥蛋白粒徑分布的影響

由圖7可知，隨著溫度升高，燕麥蛋白液滴聚集變化相對較小，當熱處理溫度為55、75和95℃時，粒徑分布峰左移，主要集中在100 μm以下，此時燕麥蛋白解離，粒徑變??；而121和130℃熱處理組燕麥蛋白粒徑分布峰向右移動，在100 μm以上出現(xiàn)大的粒徑分布峰，表明蛋白粒子進一步發(fā)生聚集。當處理溫度大于燕麥蛋白的變性溫度時，熱處理誘導蛋白部分展開，從而形成新的鍵合以及疏水等相互作用，導致較大的聚集體形成。如，球狀蛋白對溫度非常敏感，當溫度超過蛋白變性溫度時，蛋白內(nèi)部的疏水分子鏈和活性基團會暴露出來[24]。

圖7 溫度對燕麥蛋白粒徑分布的影響Fig.7 Effect of temperature on the particle size distribution of oat protein

3 討論

蛋白質的溶解性與乳化性、起泡性、凝膠性等諸多加工特性密切相關，是蛋白變性程度的一個重要表征[25]。pH值、溫度和鹽濃度等會改變這種平衡，影響水分子與蛋白質間的相互作用，從而影響蛋白質的溶解度[26]。食品體系包含一系列pH值和溫度的變化，如從酸性軟飲料和中性營養(yǎng)飲料的制備，食品加工過程中的溫度變化等。因此，確定pH值和溫度對燕麥蛋白功能特性的影響十分重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，在燕麥蛋白等電點附近，蛋白表面電荷數(shù)幾乎為零，分子間斥力減小，液滴聚集，溶解度降低，穩(wěn)定性最差。說明在中性或微酸性環(huán)境下，燕麥蛋白質的溶解度有限。當遠離等電點，蛋白質表面電荷數(shù)增多，小粒徑顆粒增多。許英一等[27]采用酶解法提取燕麥蛋白并研討其理化性質時發(fā)現(xiàn)，在燕麥蛋白等電點處，其溶解度最低，燕麥蛋白的起泡性最差，泡沫穩(wěn)定性最好，乳化性最低。Ercili-Cura等[28]發(fā)現(xiàn)燕麥蛋白分散液在pH 值為7時平均粒徑約為70 nm，而當pH值增加至9時平均粒徑下降到30 nm。上述研究均表明，當pH值接近蛋白質等電點時，蛋白質表面電荷減少，液滴之間靜電斥力減小，導致可溶性或不溶性聚集體的形成；當pH值遠離蛋白質等電點時，分子間靜電斥力增大，可有效抵御蛋白分子間的范德華引力，防止相鄰液滴相互聚集，導致蛋白質分散，粒徑變小，溶液穩(wěn)定性增加[29]。蛋白質的溶解性可以間接反映其水化作用，蛋白質在水中通過肽鍵或者氨基酸側鏈與水分子結合，生成蛋白質-水分子，并且與蛋白質-蛋白質相互作用達到熱力學平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，燕麥蛋白的溶解度升高，電位值增大，說明燕麥蛋白水化能力增強，這有助于其在水相的分散，溶液穩(wěn)定性增強，并在95℃達到最優(yōu)。Ma等[29]研究發(fā)現(xiàn)燕麥蛋白在加熱后被分解為不同的亞基，同時也會互相連接形成高分子量的聚集體。Guo等[30]考察了熱誘導不同粒徑大豆蛋白聚集體的表面性質、乳化性和乳化穩(wěn)定性，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理后，二硫鍵形成，導致聚集體的產(chǎn)生，聚集體的表面疏水性增加。結果證明，熱處理使蛋白分子內(nèi)部的疏水基團暴露于分子表面，改變分子尺寸、柔性和表面疏水性等，進而影響其溶液中的聚集行為以及其在界面上的吸附特性[31]。

4 結論

本研究結果表明，當pH值在燕麥蛋白的等電點附近(pH值5.0左右)內(nèi)，燕麥蛋白的表面電荷數(shù)幾乎為零，ζ-電位絕對值最低，此時的蛋白粒徑最大，燕麥蛋白溶解性最差，乳化性也降到最低。當pH值遠離蛋白質等電點時，燕麥蛋白的表面電荷增加，蛋白質液滴之間靜電斥力增強，液滴分布分散，粒徑變小，溶解度增加，乳化性也隨之升高。在不同的溫度處理下，隨著溫度升高(55～95℃)，燕麥蛋白解離，ζ-電位絕對值顯著增大，粒徑變小，燕麥蛋白溶解度顯著升高，燕麥蛋白溶液的穩(wěn)定性變好；當溫度進一步升高(121、130℃)，燕麥蛋白溶解度降低，穩(wěn)定性變差。燕麥蛋白是一種優(yōu)質的植物蛋白，本研究結果闡明了不同環(huán)境因素(pH值和溫度)對燕麥蛋白溶解的聚集特性的影響，為進一步改善燕麥蛋白的功能特性，使其更好地應用于食品工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的理論基礎。