絲素蛋白/泊洛沙姆載葉酸水凝膠的制備工藝研究

藍(lán)金霞，高彭飛，李家敏，張兵鋒

(宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000)

蠶絲中絲素蛋白(Silk Fibroin，SF)是一種半結(jié)晶聚合物，主要組成成分是β-折疊晶體和非晶體(微孔隙和無定形結(jié)構(gòu))，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等18種氨基酸構(gòu)成，具有良好的生物相容性、生物可降解性、pH敏感性、組織粘附性等活性[1，2]。泊洛沙姆P188是聚氧乙烯-聚氧丙稀的共聚物，常用于增加藥物的溶出，其凝膠化作用是因?yàn)椴绰迳衬稰188形成了分子間氫鍵[3]。

水凝膠(Hydrogel)是一種具有網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)的高分子材料，是以水為分散介質(zhì)的凝膠。絲素水凝膠是屬于蛋白材料中的一種形態(tài)，由于其含有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)故具有優(yōu)異的可透性和可塑性，可以作為藥物的載體，骨填充材料和細(xì)胞培養(yǎng)支架。絲素蛋白-泊洛沙姆P188水凝膠應(yīng)用于藥物緩釋系統(tǒng)，可以延緩藥物在人體的釋放、吸收、代謝及排泄，充分發(fā)揮出藥物的生物活性，保持藥效的持續(xù)性和減少藥物的毒副作用[4，5]。藥物的控釋效果可通過對(duì)絲素蛋白的β-折疊的含量改變來實(shí)現(xiàn)[6]。因此在生物醫(yī)學(xué)中備受關(guān)注，尤其在細(xì)胞增殖、藥物緩釋等方面應(yīng)用較多[7，8]。本文主要研究絲素蛋白-泊洛沙姆水凝膠的制備工藝，考察水凝膠的釋藥現(xiàn)象。

1 材料與儀器

1.1 材料

蠶絲(湖州恩貝希生物原材有限公司)；牛血清蛋白(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；考馬斯亮藍(lán)(天津中津化工有限公司)；葉酸(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：091015)；無水碳酸鈉(廣東海光華化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150227，AR)；氯化鈣(中國四聯(lián)化工廠，批號(hào)：040601，AR)；乙二胺四乙酸(天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20121121，AR)；濃磷酸(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號(hào)：200695，AR)；磷酸二氫鉀(成都科龍化工試劑廠，AR)；氫氧化鈉(天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150316，AR)；甲醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：1703091，GR)；乙醇(天津市天福達(dá)實(shí)業(yè)公司，批號(hào)：20171026，AR)。

1.2 儀器

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SQP電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；752N紫外可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；WH—3微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱(金壇市科析儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 絲素蛋白的制備

脫膠：將蠶絲剪成小片，投入浴比1:50(20 g蠶絲，5 g碳酸鈉，1000 mL去離子水)0.5 %碳酸鈉溶液中煮沸，30 min后去離子水沖洗3次。重復(fù)上述步驟2次，最后將3次脫膠后的蠶絲用去離子水洗凈，放入80 ℃烘箱內(nèi)，干燥，得到絲素[9]。

溶解：配制摩爾質(zhì)量比為CaCl2:C2H5OH:H2O =1:2:8的混合液，將絲素以1:20的浴比，放入80 ℃水浴恒溫鍋內(nèi)，攪拌2 h，溶解后得到絲素蛋白和氯化鈣的混合溶液[10]。經(jīng)冷卻后，將絲素蛋白溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(8000～12000 Da)中，用蒸餾水透析3 d，每間隔4 h替換一次蒸餾水，透析完成后，抽濾，然后放入4 ℃冰箱待用。

2.2 絲素蛋白的含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試劑：0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液；絲素蛋白溶液；考馬斯亮藍(lán)染料溶液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按表1分別向6支試管內(nèi)加入各試劑，利用微型漩渦混合儀充分混勻，5 min后采用紫外分光光度法在595 nm波長處以0號(hào)管調(diào)零，測(cè)定各試管的吸光度值(A)。以吸光度值(A)對(duì)濃度(C)作圖繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：A = 4.7221x+ 0.036。如圖1所示。

圖1 絲素蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

用移液槍精密量取絲素樣品1 mL分別置于已編好號(hào)的5支試管中，再向其中4份各加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液，再用1 mL的去離子水加5 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液調(diào)零，測(cè)量其在可見光為595 nm的波長處的吸光度分別為：0.381、0.359、0.376、0.376、0.361。計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD=0.5 %，結(jié)果說明此方法重現(xiàn)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.價(jià)值標(biāo)準(zhǔn)多元趨向明顯。學(xué)生的思想道德標(biāo)準(zhǔn)逐漸增多，追求不同的價(jià)值觀，是非觀念日漸淡薄，出現(xiàn)一些與主流價(jià)值標(biāo)準(zhǔn)不同的判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)構(gòu)建社會(huì)主義核心價(jià)值體系工作有一定程度的沖擊。

用移液槍精密吸取“重現(xiàn)性試驗(yàn)”項(xiàng)下的第3份絲素溶液1 mL，向其中加5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，再用1 mL的去離子水加5 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液調(diào)零，于0 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min時(shí)分別測(cè)定吸光度。測(cè)定結(jié)果分別為：0.568、0.557、0.554、0.548、0.541。計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.83 %，結(jié)果表明同一樣品在5 min內(nèi)的測(cè)定結(jié)果基本穩(wěn)定。

2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

使用移液槍取牛血清蛋白對(duì)照品溶液1 mL，置于試管中，并向試管中加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液，再用1 mL的去離子水加5 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液調(diào)零，在可見光為595 nm的波長處分別測(cè)其吸光度5次。測(cè)定結(jié)果為：0.284、0.283、0.293、0.282、0.291，測(cè)出的平均值為0.2866，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD=1.75 %，表明該儀器精密度良好。

2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

使用移液槍精密量取己知含量的絲素蛋白溶液0.5 mL，共5份，分別精密加入對(duì)照品牛血清蛋白液0.5 mL，置于已編好號(hào)的試管中，再向各個(gè)試管中分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，再用5mL的考馬斯亮藍(lán)溶液加1 mL的去離子水調(diào)零，在可見光的波長為595 nm處測(cè)定其吸光度分別為：0.514、0.523、0.518、0.517、0.517，回收率分別為：100.2%、103.7%、101.8%、101.4%、103.4%。計(jì)算樣品平均回收率為102.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD = 1.42%。由此數(shù)據(jù)說明建立的測(cè)定方法的準(zhǔn)確度良好?；厥章?%)=(實(shí)測(cè)絲素蛋白含量-樣品中絲素蛋白含量)/對(duì)照品加入量×100%。

2.2.6 絲素蛋白濃度的測(cè)定

取1 mL已經(jīng)過稀釋10倍的絲素溶液，加入考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL混勻，5 min后測(cè)定其在可見光為595nm處的吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程即可求得蛋白質(zhì)濃度。測(cè)定吸光度分別為：0.545、0.544、0.546，代入線性回歸方程y=4.7221 x + 0.036，得出絲素蛋白濃度分別為：0.1078 mg/mL、0.1076 mg/mL、0.1080 mg/mL。求得已稀釋的絲素蛋白的濃度平均值為0.1078 mg/mL。

2.3 絲素蛋白-泊洛沙姆載葉酸水凝膠的制備

2.3.1 絲素蛋白與泊洛沙姆的比例對(duì)水凝膠的影響

取3 mL絲素蛋白溶液分別加入5支試管中，依次將泊洛沙姆P188與絲素溶液以1:1、4:1、10:1、16:1、20:1的比例制備水凝膠，經(jīng)過比較均勻性和涂展性可得16:1的比例水凝膠的狀態(tài)為整體均勻一致，無顆粒，無團(tuán)塊，無氣泡，有彈性，容易涂抹且涂抹處皮膚舒適[11]。

2.3.2 溫度對(duì)水凝膠的影響

將泊洛沙姆與絲素溶液16:1的混合液置于37 ℃水浴中，觀察其凝膠狀態(tài)，數(shù)小時(shí)后仍為流動(dòng)的液體，將溫度逐漸上升，分別觀察在50 ℃、60 ℃、70 ℃水浴中是否形成凝膠，經(jīng)過比較均勻性和涂展性可得70 ℃時(shí)且質(zhì)量比為16:1的泊洛沙姆P188與絲素溶液形成水凝膠狀態(tài)為整體均勻一致，無顆粒，無團(tuán)塊，無氣泡，有彈性，容易涂抹且涂抹處皮膚舒適。

2.3.3 時(shí)間對(duì)水凝膠的影響

將泊洛沙姆與絲素溶液以質(zhì)量比為16:1的混合溶液放入70 ℃的水浴中，分別在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h時(shí)觀察形成凝膠的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)6 h時(shí)形成水凝膠狀態(tài)為整體均勻一致，無顆粒，無團(tuán)塊，無氣泡，有彈性，容易涂抹且涂抹處皮膚舒適。

2.4 絲素蛋白-泊洛沙姆載藥水凝膠的體外釋放

2.4.1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取葉酸0.1003 g于10 mL量瓶中，加入10 mL甲醇，超聲處理使其充分溶解，并用甲醇定容，即得到10 mg/mL的溶液；再吸取1 mL已配好的上述溶液于容量瓶中，加入磷酸鹽緩沖液，定容至刻度線，即得到1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；最后用上述同樣的方法，再精密量取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入磷酸鹽緩沖液定容，使其濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定葉酸在λ=365 nm波長處的各濃度的吸光度，建立葉酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用吸光度對(duì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.0116x- 0.0004，R2=0.9977。

2.4.2 體外釋放

在透析袋中裝入載有葉酸的絲素蛋白-泊洛沙姆水凝膠，浸入裝有pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液的錐形瓶(100 mL)中，37 ℃下在恒溫培養(yǎng)振蕩器中振蕩(頻率設(shè)為60 r/min)，每隔0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、2h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h從錐形瓶中取出4 mL的釋放液，并向錐形瓶里加入4 mL的PBS緩沖液，同時(shí)用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)量葉酸藥物在波長為365 nm處的釋放液的吸光度。根據(jù)線性回歸方程，計(jì)算釋放液的釋放量及藥物濃度，隨著時(shí)間的增長，計(jì)算出累積釋藥百分率，并繪制釋藥曲線[12]。同法測(cè)定游離葉酸的累計(jì)釋放量。如圖2所示，游離葉酸在前4 h具有突釋現(xiàn)象，累積釋放量達(dá)到了95 %，與之相比，葉酸水凝膠前4 h累積釋放量為24 %，在36 h釋放量達(dá)到50 %，具有良好的緩釋效果。

圖2 絲素蛋白-泊洛沙姆載藥水凝膠的釋藥曲線

3 討論與結(jié)論

在研究絲素蛋白-泊洛沙姆載葉酸水凝膠的制備工藝過程中，絲素蛋白和考馬斯亮藍(lán)溶液應(yīng)在一周內(nèi)配制使用。絲素蛋白在取用后立即放回4 ℃冰箱內(nèi)。在絲素蛋白進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，使用紫外分光光度計(jì)時(shí)，確保在其預(yù)熱穩(wěn)定，校準(zhǔn)調(diào)零，調(diào)節(jié)波長為595 nm后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，得到絲素蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=4.7221 x + 0.036，R2=0.9964，線性關(guān)系良好，計(jì)算得到蛋白濃度為2.5 mg/mL。

制備絲素蛋白-泊洛沙姆水凝膠的影響因素有絲素蛋白與泊洛沙姆的比例，溫度和時(shí)間[13]。通過不同比例，不同溫度，不同時(shí)間所形成的凝膠之間比較，最終確定泊洛沙姆與絲素蛋白以16:1的比例，在70 ℃水浴6 h形成的凝膠具有最優(yōu)的均勻性和涂展性。絲素蛋白水凝膠制備工藝良好，具有儲(chǔ)存和可持續(xù)釋放藥物的能力，葉酸的體外緩釋速率先快后慢，在36 h內(nèi)達(dá)到50 %，說明絲素蛋白-泊洛沙姆水凝膠可應(yīng)用于藥物的緩釋系統(tǒng)。根據(jù)此制備工藝得到的載藥水凝膠具有較優(yōu)的均勻性和涂展性，且具有一定的緩釋作用。