SLE患兒外周血TLR-4、HMGB1的表達(dá)及臨床意義

呂迎霞， 楊俊梅， 鄭莉娟， 黃慶華

（河南省兒童醫(yī)院鄭州兒童醫(yī)院 鄭州市兒童感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450053）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有10%以上的SLE在兒童期發(fā)病，相對(duì)于成人來說，兒童SLE的預(yù)后相對(duì)較差。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種強(qiáng)力的促炎因子，通過與細(xì)胞受體結(jié)合等一系列信號(hào)途徑而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)展[1]。Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR-4）與相應(yīng)的配體結(jié)合后，可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活多種免疫細(xì)胞，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和自身抗體[2]。有研究結(jié)果顯示，TLR-4、HMGB1可能存在一定的協(xié)同作用，可影響兒童SLE的發(fā)生、發(fā)展[3]。但關(guān)于TLR-4、HMGB1與兒童SLE病情相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在探討TLR-4、HMGB1在兒童SLE中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年7月—2019年7月河南省兒童醫(yī)院SLE患兒40例（SLE組）。以系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)度指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）評(píng)分≥10分的患兒作為活動(dòng)期組，其中男12例、女8例，年齡3～13歲；以SLEDAI評(píng)分＜10分的患兒作為穩(wěn)定期組，其中男13例、女7例，年齡2～11歲。40例SLE患兒中，狼瘡性腎炎患兒24例（狼瘡性腎炎組，其中活動(dòng)期11例、穩(wěn)定期13例）、非腎炎患兒16例（非腎炎組，其中活動(dòng)期9例、穩(wěn)定期7例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患兒均符合《兒科學(xué)》（第8版）[4]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）確診前未使用過免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在交流障礙；（2）伴有心、肝、腎等臟器功能不全；（3）患兒及家屬不愿意配合；（4）對(duì)本研究所涉及的藥物過敏。另選取15名體檢健康兒童作為正常對(duì)照組，其中男9名、女6名，年齡4～12歲。各組年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)河南省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

采集所有患兒入院后次日清晨、健康兒童體檢當(dāng)日清晨的空腹靜脈血5 mL，離心后分離血清，-70 ℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平，試劑盒購自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司。采用ELISA檢測(cè)抗雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）抗體水平，試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。采用間接免疫熒光法檢測(cè)抗Sm抗體水平，試劑盒購自上海川至生物技術(shù)有限公司。采用免疫比濁法檢測(cè)血清C3、C4、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、IgM、IgG水平，試劑盒均購自常州貝源鑫生物科技有限公司，檢測(cè)儀器為U-8020全自動(dòng)生化分析儀（桂林優(yōu)利特公司）。所有操作均嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估各項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE組與正常對(duì)照組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平的比較

SLE組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.001）。見表1。

SLE活動(dòng)期組、穩(wěn)定期組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.05），且SLE活動(dòng)期組4項(xiàng)指標(biāo)均高于穩(wěn)定期組（P＜0.05）。見表2。

2.2 狼瘡性腎炎組、非腎炎組及正常對(duì)照組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平的比較

狼瘡性腎炎組及非腎炎組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.05），且狼瘡性腎炎組4項(xiàng)指標(biāo)水平均高于非腎炎組（P＜0.05）。見表3。

表1 SLE組與正常對(duì)照組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平的比較 x±s

表2 SLE活動(dòng)期組、穩(wěn)定期組及正常對(duì)照組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平的比較 ±s

表2 SLE活動(dòng)期組、穩(wěn)定期組及正常對(duì)照組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平的比較 ±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與活動(dòng)組比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) IL-17/（pg/mL） IL-23/（pg/mL） HMGB1/（μg/mL） TLR-4/（ng/mL）活動(dòng)期組 20 226.23±106.17* 189.22±73.46* 25.18±2.77* 90.15±5.17*穩(wěn)定期組 20 172.41±48.25*# 137.03±40.15*# 16.35±0.95*# 84.34±7.01*#正常對(duì)照組 15 76.39±18.25 46.23±17.07 12.16±0.47 65.29±7.45 F值 19.160 33.429 248.600 65.580 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 狼瘡性腎炎組、非腎炎組及正常對(duì)照組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平的比較 ±s

表3 狼瘡性腎炎組、非腎炎組及正常對(duì)照組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平的比較 ±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與非腎炎組比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) IL-17/（pg/ml） IL-23/（pg/mL） HMGB1/（μg/mL） TLR-4/（ng/mL）狼瘡性腎炎組 24 206.20±102.17*# 191.31±75.06*# 26.02±2.37* 92.14±2.17*#非腎炎組 16 152.36±43.14* 142.13±40.67* 18.76±1.88* 82.06±5.22*正常對(duì)照組 15 76.39±18.25 46.23±17.07 12.16±0.47 65.29±7.45 F值 14.850 31.960 254.740 133.720 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 SLE患兒各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性

HMGB1與TLR-4、IL-17、IL-23均呈正相關(guān)（r值分別為0.424、0.563、0.498，P＜0.05）。IL-17與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.726，P＜0.05），與抗dsDNA抗體、抗Sm抗體、C3、C4、IgM、IgG及CRP均無相關(guān)性（r值分別為0.133、0.067、0.143、-0.450、0.214、0.022、0.031，P＞0.05）。IL-23與SLEDAI評(píng)分、IgM、IgG、CRP均呈正相關(guān)（r值分別為0.615、0.321、0.465、0.587，P＜0.05），與C3、C4均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.461、-0.399，P＜0.05），與抗dsDNA抗體、抗Sm抗體均無相關(guān)性（r值分別為0.076、0.046，P＞0.05）。HMGB1與SLEDAI評(píng)分、抗dsDNA抗體、IgM、IgG均呈正相關(guān)（r值分別為0.727、0.659、0.487、0.550，P＜0.05），與C3呈負(fù)相關(guān)（r=-0.367，P＜0.05），與抗Sm抗體、C4、CRP均無相關(guān)性（r值分別為0.058、-0.238、0.136，P＞0.05）。TLR-4與SLEDAI評(píng)分、抗dsDNA抗體、CRP、IgM均呈正相關(guān)（r值分別為0.762、0.721、0.614、0.636，P＜0.05），與C3、C4均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.520、-0.434，P＜0.05），與抗Sm抗體、IgG均無相關(guān)性（r值分別為0.046、0.045，P＞0.05）。

3 討論

SLE的發(fā)病因素目前尚未被完全闡明，一般認(rèn)為是在各種因素相互作用下，T淋巴細(xì)胞被激活、B淋巴細(xì)胞增生，產(chǎn)生大量抗體，與體內(nèi)對(duì)應(yīng)的抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物[5]，在皮膚、血管、腎小球等參與下引起急、慢性炎癥和組織壞死，從而導(dǎo)致各系統(tǒng)的損傷。T淋巴細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）17主要分泌IL-17、IL-23等細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的促炎作用[6]。有研究結(jié)果顯示，自身免疫性疾病患者IL-17表達(dá)異常，而IL-23在Th17的增殖中起重要作用，可促進(jìn)Th釋放IL-17[7]。

HMGB1是高遷移率族蛋白（high mobility group protein，HMG）家族中的一員，是一種核內(nèi)非組蛋白，在不同狀態(tài)下與DNA結(jié)合，維持核內(nèi)小體結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞生存與生長(zhǎng)的必須蛋白[8]。HMGB1還可分泌到核外，是一種強(qiáng)大的新型致炎因子，可通過體內(nèi)單核細(xì)胞的刺激或壞死細(xì)胞的被動(dòng)分泌在細(xì)胞外參與機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)[9]。此外，HMGB1作為促炎細(xì)胞因子，還參與了體內(nèi)炎癥的發(fā)生及發(fā)展過程[10-11]。有研究結(jié)果顯示，TLR-4可能作為HMGB1的受體共同參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在HMGB1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞活化中起重要作用；而TLR-4被HMGB1激活后可修復(fù)白細(xì)胞介素受體激酶（interleukin receptor kinase，IRAK），繼而激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑，產(chǎn)生炎癥應(yīng)答[12]。有研究結(jié)果顯示，SLE患兒血漿和血清中HMGB1水平顯著升高，HMGB1的核內(nèi)復(fù)合物可激活抗原細(xì)胞，影響抗dsDNA抗體，從而促進(jìn)SLE患者的免疫耐受機(jī)制損傷[10，13]。還有研究結(jié)果顯示，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和狼瘡性腎炎患者HMGB1水平明顯升高[11]，提示HMGB1與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，SLE組血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平高于正常對(duì)照組（P＜0.05），且SLE活動(dòng)期組高于穩(wěn)定期組（P＜0.05），狼瘡性腎炎組高于非腎炎組（P＜0.05），提示IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4可能參與了SLE的發(fā)生、發(fā)展[14]。相關(guān)分析結(jié)果顯示，HMGB1與TLR-4、IL-17、IL-23均呈正相關(guān)（r值分別為0.424、0.563、0.498，P＜0.05）；IL-17與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.726，P＜0.05）；IL-23與SLEDAI評(píng)分、IgM、IgG、CRP均呈正相關(guān)（r值分別為0.615、0.321、0.465、0.587，P＜0.05），與C3、C4均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.461、-0.399，P＜0.05）；HMGB1與抗dsDNA抗體、抗Sm抗體、IgM、IgG均呈正相關(guān)（r值分別為0.727、0.659、0.487、0.550，P＜0.05），與C3呈負(fù)相關(guān)（r=-0.367，P＜0.05）；TLR-4與SLEDAI評(píng)分、抗dsDNA抗體、CRP、IgM均呈正相關(guān)（r值分別為0.762、0.721、0.614、0.636，P＜0.05），與C3、C4水平均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.520、-0.434，P＜0.05）。由此可見，SLE患者血清IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4水平升高可能與SLE疾病活動(dòng)有關(guān)，或可作為SLE疾病活動(dòng)的參考指標(biāo)[15]。

綜上所述，IL-17、IL-23、HMGB1及TLR-4與SLE的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系，對(duì)SLE的腎臟損傷也有一定的提示作用。