蒿葉霞, 顏新生, 楊薈薈, 胡元萍, 廖 鑫, 劉澤金
(武漢亞心總醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北 武漢 430056)
嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2)屬于β屬冠狀病毒,基因組為線性的單股正鏈RNA,為已知可感染人類的第7種冠狀病毒[1],其基因特征與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndromecoronavirus,SARS-CoV)和中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndromecoronavirus,MERS-CoV)有明顯區(qū)別。我國將SARS-CoV-2核酸檢測作為新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)的確診方法。本研究旨在通過SARS-CoV-2核酸檢測,監(jiān)測SARS-CoV-2核酸在患者體內(nèi)持續(xù)時間及載量變化趨勢,進(jìn)而分析病毒載量與COVID-19疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性,為更好地預(yù)防和控制疾病傳播提供理論依據(jù)。
收集2020年1月29日—2月22日武漢亞心總醫(yī)院COVID-19患者264例,包括SARS-CoV-2核酸檢測陽性的確診患者158例,及首次SARSCoV-2核酸檢測陰性者104例或可疑者2例,但臨床癥狀和電子計(jì)算機(jī)斷層掃描結(jié)果符合《新型冠狀病毒肺炎診療指南(試行第五版)》[2]臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),后期經(jīng)核酸檢測確診為COVID-19的患者106例。根據(jù)診療指南將患者分為輕癥組(包括輕型和普通型)和重癥組(包括重型和危重型)。記錄2組患者CT值變化趨勢及入院后核酸的轉(zhuǎn)陰時間。以連續(xù)2次核酸檢測均為陰性的末次檢測時間作為患者核酸轉(zhuǎn)陰的時間。本研究經(jīng)武漢亞心總醫(yī)院倫理審查委員會審核通過(WAGHMWC-KY-2020004),并批準(zhǔn)予以豁免患者知情同意。
核酸提取試劑為Magen磁珠法病毒總核酸提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)。自動核酸提取儀購自美國Thermo Fisher公司,新型冠狀病毒ORF1ab/N基因雙重核酸檢測試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。Cobas Z480型熒光定量PCR擴(kuò)增儀購自瑞士羅氏公司。
采集所有研究對象鼻咽拭子,置于含病毒保存液的一次性病毒采樣管(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)內(nèi),24 h內(nèi)完成檢測。
樣本采集后首先進(jìn)行56 ℃、30 min滅活處理。滅活后根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行病毒核酸的提取。SARS-CoV-2核酸檢測采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù),針對SARS-CoV-2基因組中開放閱讀框(open reading frame 1ab,ORF1ab)基因和核殼蛋白(nucleocapsid protein,N)基因進(jìn)行檢測。核酸檢測結(jié)果(Ct值)判讀以試劑說明書建議為準(zhǔn),對可疑結(jié)果通知臨床重新采樣復(fù)查。實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果確定為陽性,需滿足同1份樣本中SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因至少1個靶標(biāo)特異性實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果陽性。
采用MedCalc軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組患者的Ct值比較和核酸轉(zhuǎn)陰時間比較均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
264例COVID-19患者中,男142例,女122例,年齡(55.7±16.11)歲。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療指南(試行第五版)》[2]將患者分為輕癥組(包括輕型和普通型)和重癥組(包括重型和危重型)2組,其中輕癥組243例,重癥組21例。
重癥組患者病毒載量(Ct值為25.80±4.46)高于輕癥組患者(Ct值為30.25±4.26),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1。
截至2020年3月7日,輕癥組患者仍有34人SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果未轉(zhuǎn)陰,重癥組患者仍有4例未轉(zhuǎn)陰,未列入統(tǒng)計(jì)范圍。重癥患者核酸轉(zhuǎn)陰時間(26.7±5.6)d較輕癥患者(16.3±4.7)d長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表1)。根據(jù)21例重癥患者Ct值變化作圖進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)COVID-19患者發(fā)病早期病毒載量(Ct值)水平較高,隨著治療時間逐漸降低直至轉(zhuǎn)陰(圖1)。
表1 2組患者的病毒載量和病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間比較±s
表1 2組患者的病毒載量和病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間比較±s
組別 病毒載量 病毒轉(zhuǎn)陰時間/d輕癥組 30.25±4.26 16.3±4.7重癥組 25.80±4.46 26.7±5.6 P值 <0.001 <0.001
圖1 COVID-19重癥患者Ct值在診療過程中的變化趨勢
COVID-19疫情傳播迅速,對人民群眾生命安全和身體健康造成了嚴(yán)重的威脅。SARSCoV-2核酸檢測是確診COVID-19和患者痊愈出院的主要依據(jù),SARS-CoV-2核酸在體內(nèi)的持續(xù)時間和病毒載量變化情況是臨床治療和開展防疫工作所關(guān)注的問題。
本研究發(fā)現(xiàn),COVID-19重癥組患者體內(nèi)SARS-CoV-2病毒載量(Ct值為25.80±4.46)明顯高于輕癥組患者(Ct值為30.25±4.26)(P<0.001),且SARS-CoV-2核酸在重癥組患者體內(nèi)存在時間[(26.7±5.6)d]明顯長于輕癥組患者[(16.3±4.7)d](P<0.001),這在一定程度上說明核酸病毒載量與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān),早期重點(diǎn)關(guān)注并進(jìn)行有效的治療可以減少患者由輕型向重型轉(zhuǎn)變的風(fēng)險,進(jìn)而降低患者病死率。
本研究還發(fā)現(xiàn),多數(shù)COVID-19患者在疾病早期SARS-CoV-2病毒載量即達(dá)到高峰,隨著治療進(jìn)展和時間的推移,病毒載量逐漸降低,直至轉(zhuǎn)陰,與其他研究[3-4]報道的SARS-CoV-2的傳播可能發(fā)生在感染早期的結(jié)論一致。2003年非典型性肺炎疫情后有學(xué)者發(fā)現(xiàn),SARS-CoV的傳播主要發(fā)生在發(fā)病后數(shù)天[5],并與疾病早期呼吸道病毒載量有關(guān),病毒載量在癥狀出現(xiàn)后約10 d達(dá)到峰值[6]。所以,COVID-19的防控策略可能需要更加嚴(yán)格,對于早期出現(xiàn)癥狀的患者要及時診斷和隔離。
本研究在病例分析過程中還發(fā)現(xiàn),患者在治療過程中出現(xiàn)SARS-CoV-2核酸檢測陰性,隨后又轉(zhuǎn)為陽性的情況,這可能與病毒感染的部位、樣本類型以及樣本采集與存放方法、RNA提取方法和核酸檢測試劑盒性能等多方面因素有關(guān)[7],導(dǎo)致核酸檢測結(jié)果與臨床癥狀、影像學(xué)檢查結(jié)果不相符。本研究患者痊愈出院標(biāo)準(zhǔn)同時參考核酸轉(zhuǎn)陰時間和臨床表現(xiàn)。在COVID-19患者SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果轉(zhuǎn)陰,尚不能排除假陰性時,需重新采樣送檢,2次及以上(間隔24 h)核酸檢測均為陰性,方可確認(rèn)SARSCoV-2核酸轉(zhuǎn)陰。
本研究尚有不足之處,未能收集到所有患者首次核酸檢測陽性的時間,尤其在早期存在確診后不能及時收治的情況下,首次診斷時間尤為重要,需要通過更加全面的流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)一步深入研究。