SARS-CoV-2 N蛋白和S蛋白抗體檢測在COVID-19診斷中的應(yīng)用

田亞玲， 魯君艷

（永州市中心醫(yī)院檢驗科，湖南 永州 425000）

目前，新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）確診依據(jù)仍為熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）和病毒基因測序。但核酸檢測結(jié)果陰性不能排除嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1]首次將血清SARS-CoV-2特異性抗體作為COVID-19確診的指標(biāo)之一。徐萬洲等[2]的研究結(jié)果顯示，血清SARS-CoV-2免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M抗體和IgG抗體聯(lián)合檢測可以與SARSCoV-2核酸檢測互補。血清SARS-CoV-2抗體檢測不僅簡單、快速，而且能區(qū)分急性感染和既往感染，更適合基層醫(yī)院使用。SARS-CoV-2中至少有27種蛋白質(zhì)，包括15種非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1～nsp10，nsp12～nsp16）、4種結(jié)構(gòu)蛋白（S、E、M和N）和8種輔助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14）[3]。嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）的2種結(jié)構(gòu)蛋白具有良好的免疫原性，免疫原性最強的是核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白，N蛋白在包裝成為成熟病毒之前就已經(jīng)在細胞內(nèi)大量表達，是感染過程中表達數(shù)量最多的病毒相關(guān)蛋白[4]；其次是刺突（spike，S）蛋白，由S1亞單位和S2亞單位組成，S1亞單位包含受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD），可與宿主細胞的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結(jié)合[5]。S蛋白能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，是診斷和疫苗研究的理想抗原[6]。目前，關(guān)于SARS-CoV-2哪種蛋白用于抗體檢測來診斷SARS-CoV-2感染較好尚無相關(guān)報道。為此，本研究選擇分別以SARS-CoV-2 N蛋白和S蛋白的RBD片段為包被抗原的4種酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，并比較其診斷性能。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年1月21日—2月8日永州市中心醫(yī)院確診的COVID-19患者（COVID-19組）39例，其中男24例、女15例，年齡5～56歲。SARS-CoV-2核酸檢測均為陽性。COVID-19患者樣本采集時的患病時間為（20±5）d。選取同期永州市中心醫(yī)院收治的咳嗽、發(fā)熱或肺炎患者40例（疾病對照組），其中男25例、女15例，年齡14～58歲。收集2019年8—10月永州市中心醫(yī)院保存的體檢健康者樣本225份（正常對照組），其中男性樣本134份、女性樣本91份，體檢健康者年齡18～62歲。正常對照組和疾病對照組均經(jīng)核酸檢測排除SARS-CoV-2感染。3個組年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗體ELISA試劑盒、SARS-CoV-2 RBD IgM抗體ELISA試劑盒、SARS-CoV-2 N蛋白IgG抗體ELISA試劑盒和SARS-CoV-2 RBD IgG抗體ELISA試劑盒均購自同昕生物技術(shù)（北京）有限公司。檢測儀器為SK201半自動酶標(biāo)分析儀（深圳市盛信康科技有限公司）。

1.2.2 血清SARS-CoV-2抗體檢測

采集所有對象靜脈血2 mL，離心分離血清。所有血清檢測前均經(jīng)56 ℃滅活。根據(jù)試劑說明書，以2倍陰性對照值為Cut-off值，以S/CO＞1判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗采用K-S檢驗。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項指標(biāo)診斷COVID-19的價值，以IgM抗體和IgG抗體任意一項陽性作為聯(lián)合檢測陽性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COVID-19組與對照組血清SARS-CoV-2 N蛋白抗體、SARS-CoV-2 RBD抗體的S/CO值比較

COVID-19組SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗體、IgG抗體及SARS-CoV-2 RBD IgM抗體、IgG抗體的S/CO值均高于正常對照組（P＜0.05）和疾病對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 各項指標(biāo)診斷COVID-19的價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗體、IgG抗體、IgM+IgG抗體聯(lián)合檢測及SARS-CoV-2 RBD IgM抗體、IgG抗體、IgM+IgG抗體聯(lián)合檢測診斷COVID-19的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.949、0.991、0.992、0.994、0.999、0.999，見表2、圖1。

表1 COVID-19組、疾病對照組及正常對照組4種血清SARS-COV-2抗體的S/CO值比較M（P25～P75）

SARS-CoV-2 RBD IgG抗體診斷COVID-19的敏感性高于SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗體（P＜0.05），與其他各項指標(biāo)之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。SARS-CoV-2 RBD IgG抗體診斷COVID-19的特異性與SARS-CoV-2 RBD IgM+IgG抗體聯(lián)合檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與其他各項指標(biāo)之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各項指標(biāo)診斷COVID-19的效能

圖1 各項指標(biāo)診斷COVID-19的ROC曲線

3 討論

本研究結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 N蛋白IgM抗體診斷COVID-19的敏感性最低，且低于N蛋白IgG抗體的檢出率，其原因可能與患者采集樣本時患病時間已較長[距離發(fā)病的時間為（20±5）d]有關(guān)。徐萬洲等[2]的研究顯示，在SARS-CoV-2 IgG抗體單陽性患者中，IgG抗體陽性的中位天數(shù)為24 d?；颊叽穗A段因經(jīng)過治療或病情好轉(zhuǎn)，IgM水平處于下降階段，IgG水平處于維持階段，所以在此時間段存在N蛋白IgM抗體轉(zhuǎn)為陰性的可能。SARS-CoV-2 N蛋白的IgM抗體和IgG抗體的敏感性低于RBD-IgM抗體和IgG抗體，可能與這2種蛋白的特性相關(guān)。對SARS-CoV N蛋白和S蛋白的研究結(jié)果顯示，N蛋白表達量較高，表達時間較早[7]，但S蛋白抗體的持久性優(yōu)于N蛋白抗體。LI等[8]的研究結(jié)果顯示，SARS-CoV N蛋白抗體水平在發(fā)病6個月內(nèi)呈小幅下降，6～24個月時抗體水平顯著下降；SARS-CoV S蛋白抗體在發(fā)病后的24個月內(nèi)，抗體一直處于較穩(wěn)定的水平。因此，SARS-CoV-2 N蛋白和S蛋白的抗體可能也具有類似的特點，但這需要收集SARS-CoV-2感染者不同時間段的樣本進行抗體跟蹤檢測才能驗證。N蛋白IgM抗體檢測敏感性較低的缺點可以通過IgM和IgG聯(lián)合檢測進行克服。N蛋白IgM+IgG抗體聯(lián)合檢測診斷COVID-19的敏感性為97.4%，高于N蛋白IgM抗體的敏感性（82.1%）。

本研究結(jié)果還顯示，SARS-CoV-2 RBD IgG抗體的特異性最高。原因可能與SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白與其他病毒的同源性不同相關(guān)。SARS-CoV-2與SARS-CoV的N蛋白序列相似性為94%，蛋白同源性很高，說明N蛋白比較保守，易于其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。WRAPP等[9]的研究結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 S蛋白與SARSCoV S蛋白的氨基酸序列相似度為76.47%；3種針對SARS-CoV RBD的多克隆抗體與SARSCoV-2的RBD完全沒有結(jié)合力。由此可見，盡管SARS-CoV-2與SARS-CoV有較高的同源性，但二者RBD片段的交叉反應(yīng)較少。因此，將S蛋白中的RBD作為抗原來檢測血清中的抗體，對診斷SARS-CoV-2感染有較好的特異性。此外，SARS-CoV-2 RBD IgM抗體的特異性低于RBD IgG抗體的特異性（P＜0.05）。在正常對照組中，13份RBD IgM抗體假陽性樣本的S/CO值為1.25（1.13～1.60），均為弱陽性樣本，可能與血清中存在類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、補體等干擾物質(zhì)有關(guān)。

本研究的樣本采集時間處于SARS-CoV-2感染的后期。ROC曲線分析顯示，此階段SARSCoV-2 RBD抗體的Youden指數(shù)高于N蛋白抗體。因此，對于已處于SARS-CoV-2感染后期的患者，采用S蛋白RBD抗體診斷COVID-19的臨床價值更高，但在COVID-19早期診斷中的價值還需進一步研究。

綜上所述，SARS-CoV-2 S蛋白RBD抗體檢測在SARS-CoV-2感染后期的患者中價值更高。本研究的不足之處在于樣本量較小，采樣時患者發(fā)病時間已較長，未能動態(tài)監(jiān)測SARS-CoV-2不同感染階段抗體的變化。因此，本研究的結(jié)論還需大樣本量進行驗證。