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    肌酸激酶MM同工酶在新生兒杜氏肌營養(yǎng)不良癥篩查中的應用

    2020-12-03 01:44:22王燕敏田國力張瀟分
    檢驗醫(yī)學 2020年11期
    關鍵詞:熒光法濾紙篩查

    王燕敏, 田國力, 紀 偉, 張瀟分

    (上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心,上海 200040)

    杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是進行性肌營養(yǎng)不良癥中最常見也是病情最嚴重的一種遺傳病,男性新生兒的發(fā)病率為1/6 000~1/5 000[1]。DMD是由于X染色體上編碼抗肌萎縮蛋白基因突變,導致抗肌萎縮蛋白缺失或缺陷,起病較隱匿,女性多為攜帶者,男性患者多于3~5歲起病,常表現(xiàn)為進行性加重的肌無力、肌萎縮及站立困難,10~12歲出現(xiàn)站立或行走困難,只能靠輪椅行動,20歲時需要輔助呼吸,30~40歲時因呼吸或心力衰竭而死亡。在DMD患兒出現(xiàn)臨床癥狀前進行診斷,結合多學科的綜合評估和管理,可極大延長患者獨立行走的時間和生存期,提高患者的生存質量[2-3]。英國、德國、美國等國家已進行新生兒DMD篩查,以肌酸激酶(creatine kinase,CK)作為篩查指標,若呈陽性則召回患兒進行DMD基因檢測[4]。肌酸激酶MM同工酶(creatine kinase isoenzyme MM,CK-MM)是骨骼肌中CK的主要同工酶形式,其在DMD患者中更具特異性[5]。本研究擬評估CK-MM用于DMD篩查的可行性,為今后廣泛開展新生兒DMD篩查提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 研究對象

    1.1.1 男性新生兒濾紙干血片樣本 收集2019年6—10月上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心進行遺傳病篩查的男性新生兒濾紙干血片樣本7 035份,男性新生兒出生體質量為3 373(1 100~5 490)g,母親孕周為39(28~43)周,采血時間為出生后4(2~6)d。按美國臨床實驗室標準化協(xié)會(the Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)C28-A3c文件的要求,將所有檢測結果進行排序,以低于第97.5百分位數(shù)(P97.5)者作為正常對照組。本研究經(jīng)上海市兒童醫(yī)院倫理委員會審查批準,受檢者直系親屬均簽署知情同意書。

    1.1.2 DMD患兒 選取2016年3月—2019年7月于上海市兒童醫(yī)院確診的DMD患兒25例,其中男24例、女1例,年齡2個月~12歲?;純号R床表現(xiàn)為雙下肢無力、易摔倒、步態(tài)異常、心肌酶譜異常、進行性肌營養(yǎng)不良、肌源性損傷等。實驗室診斷標準[6]:血清CK異常,多重連接依賴式探針擴增技術(multiplex ligationdependent probe amplification,MLPA)、醫(yī)學外顯子組序列和拷貝數(shù)分析后確認為DMD基因缺失、增加或變異。在患兒進行相關遺傳咨詢時,本著自愿的原則,獲得患兒父母知情同意后采集患兒外周血樣本。

    1.2 方法

    采集所有對象微量血,滴于S&S903濾紙上,室溫下自然晾干,-20 ℃冰箱保存待檢。取3 mm直徑血斑統(tǒng)一檢測。

    Genetic Screening Processor 2021全自動熒光免疫分析儀及配套CK-MM測定試劑盒(時間分辨熒光法)、Panthera-Puncher 9打孔儀均購自美國PerkinElmer公司。嚴格按儀器和試劑說明書進行操作。

    1.3 CK-MM檢測原理

    采用固相雙抗體雙位點熒光免疫法檢測CKMM。微孔板上固相小鼠單克隆抗體和銪離子標記的小鼠單克隆抗體可識別CK-MM分子表面2個獨立的抗原位點并發(fā)生結合反應,未結合的標記從板孔中沖離。加入誘導劑將已結合的銪離子從微孔板上洗脫并與誘導劑中的成分形成具有高熒光強度的螯合物。該螯合物的熒光強度與濾紙干血片樣本中的CK-MM濃度呈正比。

    1.4 DMD診斷流程

    若濾紙干血片樣本的CK-MM檢測結果高于篩查人群的P97.5[7],判定為篩查陽性,需進一步采集靜脈血檢測血清CK,如血清CK>200 U/L判定為異常,隨后行MLPA、醫(yī)學外顯子組序列和拷貝數(shù)分析,若有DMD基因缺失、增加或變異則確診為DMD。

    1.5 方法學評價

    1.5.1 精密度 取CK-MM試劑盒提供的低值(138 ng/mL)、中值(402 ng/mL)和高值(1 660 ng/mL)質控樣本,每份樣本各測定20次,計算批內(nèi)變異系數(shù)(coefficient of variation,CV);每份樣本各測定4次,連續(xù)測定5 d,計算批間CV。

    1.5.2 正確度 取低值(138 ng/mL)、中值(402 ng/mL)和高值(1 660 ng/mL)質控樣本,復孔檢測,重復測定15次,計算均值與靶值的偏移。

    1.5.3 線性范圍 取試劑盒提供的已知濃度的校準品(8 000 ng/mL),取直徑3 mm的血斑樣本,按1、1/2、1/4、1/8血斑制作系列濃度樣本,每份樣本重復檢測2次。以理論值為X,實測值均值為Y,計算回歸方程和r值。

    1.6 統(tǒng)計學方法

    采用Excel 2010軟件及SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單樣本K-S檢驗進行正態(tài)性檢驗。非正態(tài)分布資料以中位數(shù)(M)[四分位數(shù)(P25~P75)]表示,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評估CK-MM篩查DMD的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 時間分辨熒光法檢測CK-MM的方法學評價

    2.1.1 精密度結果 低、中、高值樣本的批內(nèi)CV分別為9.89%、7.08%、7.27%,批間CV分別為8.35%、7.13%、7.37%,均<10%。見表1。

    表1 時間分辨熒光法檢測CK-MM的精密度結果

    2.1.2 正確度結果 低值、中值、高值樣本的偏移范圍分別為-9.34%~12.79%、-10.27%~12.23%、-10.15%~13.51%,均在±15%之間,平均相對偏移分別為0.32%、-1.09%、0.80%。見圖1。

    圖1 時間分辨熒光法檢測CK-MM的偏移分布

    2.1.3 線性結果 以實測均值為Y,系列理論值為X,進行線性回歸分析,線性范圍為6.8~8 780 ng/mL,回歸方程為Y=1.045 8X+1.929 6(r=0.999 9,P<0.01)。實測均值與理論值高度相關,線性良好。

    2.2 新生兒篩查結果

    7 035 名男性新生兒的CK-MM濃度范圍為8.68~7 271.91 ng/mL,數(shù)據(jù)呈正偏態(tài)分布(P<0.000 1)。CK-MM中位數(shù)為93.06 ng/mL,主要分布范圍為8.68~400.00 ng/mL,占總樣本數(shù)的96.49%,>400 ng/mL的累積百分比增長趨緩。見圖2。

    圖2 7 035名男性新生兒濾紙干血片樣本CK-MM濃度分布及累積百分比

    按CLSI C28-A3c文件的要求,以P97.5的值(713 ng/mL)為初始臨界值,7 035名男性新生兒中有6例(0.085%)CK-MM≥713 ng/mL(篩查陽性),均值為2 189.02 ng/mL,范圍為713.33~7 271.91 ng/mL;有7 029名CK-MM<713 ng/mL(正常對照者),數(shù)據(jù)呈正偏態(tài)分布(P<0.000 1),為91.93(60.16~139.65)ng/mL。

    6例篩查陽性患兒召回后進行血清CK檢測,4例結果正常,排除DMD;2例CK結果分別為3 270、13 100 U/L,檢測DMD基因,均為半合變異,基因型分別為c.1990C>T(p.Gln664*)和c.7657C>T(p.Arg2553*),確診為DMD。CK-MM篩查新生兒DMD的陽性預測值為33.33%(2/6),男性發(fā)病率為1∶3 518。

    2.3 CK-MM診斷DMD的效能評價

    27例DMD患兒(25例DMD患兒,2例篩查確診患兒)的基因檢測結果分別為半合缺失21例、拷貝數(shù)增加1例、女性雜合缺失1例、半合變異4例。DMD患兒CK-MM濃度為6 169.69(2 361.13~8 301.66)ng/mL,明顯高于正常對照組[91.93(60.16~139.62)ng/mL](P<0.000 1),是正常對照組的67倍。27例DMD患兒CK-MM、CK及基因檢測結果見表2。

    ROC曲線分析結果顯示,以正常對照組為對照CK-MM診斷DMD的曲線下面積(area under curve,AUC)為1.0,最佳臨界值為762 ng/mL,敏感性為100%,特異性為99.94%。見圖3。

    表2 27例DMD患兒CK-MM、CK及基因檢測結果

    圖3 CK-MM診斷DMD的ROC曲線

    3 討論

    DMD是最常見的X連鎖先天性肌病,至今無治愈手段。近年來,隨著藥物治療、基因治療、骨髓干細胞移植等取得的重大進展,DMD逐步受到臨床關注[8-9]。有研究結果顯示,早期使用糖皮質激素可有效改善患者的運動功能,提高患者的生存質量和存活時間[6]。因此,在新生兒期對DMD進行篩查可以早期診斷,盡早治療,結合心臟、呼吸、骨骼和康復等多學科干預可顯著提高患者生活質量,延緩疾病進程,延長患者生存期,還能為有先證者家庭的下一胎產(chǎn)前診斷提供幫助。據(jù)美國醫(yī)學協(xié)會的報道,1975—2011年間全球有1 800萬新生兒接受DMD篩查,確診344例DMD[10]。1990—2011年間,英國威爾士地區(qū)采用CK篩查343 170名男嬰,確診72例DMD,男孩發(fā)病率為1∶4 767[11]。本研究對7 035名新生男嬰進行篩查,確診2例DMD,發(fā)病率為1∶3 518。

    CK一直是DMD診斷的重要指標,這是由于DMD基因變異可引起肌肉發(fā)生萎縮或炎癥,CK從被破壞的肌肉組織中釋放進入血液,使血清CK濃度升高。但CK濃度易受年齡、性別、種族、地域、運動狀態(tài)、疾病等多種因素的影響,且如何界定CK檢測值與DMD之間的關系尚無明確標準[12]。CK-MM是CK在骨骼肌中存在的主要同工酶形式,CK-MM作為骨骼肌損傷的指標比CK更具特異性[13],且相對于檢測血清CK,檢測濾紙干血片樣本CK-MM的創(chuàng)傷更小、成本更低,且運輸方便,適合大規(guī)模篩查[5]。本實驗室在國內(nèi)率先通過檢測濾紙干血片中的CK-MM開展新生兒DMD篩查。本研究對時間分辨熒光法檢測濾紙干血片CK-MM的性能進行驗證,結果顯示批內(nèi)CV、批間CV和平均偏移均<10%,實測值與理論值的r=0.999 9。27例DMD患兒的CK-MM均>1 000 ng/mL,中位濃度是正常對照組的67倍。ROC曲線分析結果顯示,CK-MM診斷DMD的敏感性為100%,特異性為99.99%,提示CK-MM對DMD有很好的診斷價值。

    DMD為X連鎖遺傳,女性多為無癥狀攜帶者,但約有10%的女性攜帶者可有輕度的臨床表現(xiàn),極少數(shù)出現(xiàn)類似于男性患兒的嚴重癥狀,部分女性成年期出現(xiàn)DMD相關性擴張性心肌病,引起左心室擴張和充血性心力衰竭[14]。本研究中有1例女性DMD雜合子基因確診患者,CK-MM為1 949.46 ng/mL,因CK濃度升高就診,就診時已見步態(tài)異常。因本研究未將女性新生兒納入篩查,所以無女性DMD發(fā)病率等數(shù)據(jù)。此例患兒提示今后應不分性別對所有新生兒開展DMD篩查。

    綜上所述,以濾紙干血片為樣本檢測CK-MM能有效篩查出DMD患兒,且檢測方法簡便,值得在臨床推廣。

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