26S蛋白酶體ATP酶亞基2在非小細胞肺癌患者中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系*

吳偉銘，趙天成，郭翔，楊異

200233上海, 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院 胸外科

肺癌目前仍然是國內(nèi)外發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1],其中約 85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，嚴(yán)重危害國民健康。大多數(shù)NSCLC 患者在確診時已為晚期，失去了最有效的手術(shù)治療機會，而內(nèi)科治療中各種化療方案的客觀反應(yīng)率僅為 25%左右且毒副反應(yīng)大,因此積極探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的臨床意義。然而，腫瘤的發(fā)生又有著十分復(fù)雜的因素。一項針對3 000多例腫瘤的研究表明除驅(qū)動癌癥增殖的經(jīng)典基因外，可能還存在著促進癌癥發(fā)生的56個必要基因，這其中占據(jù)首位的就是26S蛋白酶體ATP酶亞基2(proteasome 26S subunit ATPase 2，PSMC2)基因，并且該研究指出PSMC2基因在癌細胞中的一個拷貝頻繁丟失，會導(dǎo)致細胞生存危機，同時研究小組在荷瘤(卵巢癌)小鼠中發(fā)現(xiàn) PSMC2表達受到抑制后腫瘤顯著縮小[2]。近來更有研究發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌、腸癌的發(fā)生發(fā)展中也具有相類似的表現(xiàn)[3-4]。但目前尚無PSMC2蛋白在NSCLC中的表達狀況及其臨床意義的報道，因此我們進行了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料與隨訪

選取2012年1月至2014年10月在上海交通大學(xué)附屬第六人民胸外科接受手術(shù)治療的58例NSCLC患者，收集其一般臨床資料，并從該院病理科調(diào)取這些病例的石蠟標(biāo)本(癌組織及癌旁組織)。其中男性39例，女性19例。年齡38～78歲，中位年齡64歲。無吸煙史31例，有吸煙史27例，其中吸煙指數(shù)(每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))<400者7例，≥400者20例。腫瘤位于右上葉17例，右下葉6例，右中葉6例，左上葉21例，左下葉8例。中央型22例，周圍型36例。腫瘤最大直徑0.8～9 cm。術(shù)后病理類型：腺癌32例，鱗癌19例，其他類型共7例(大細胞癌3例，低分化癌1例，淋巴上皮瘤樣癌1例，肉瘤樣癌1例，腺鱗癌1例)。手術(shù)后通過電話隨訪方式了解這58例患者術(shù)后生存狀況，隨訪截止日期為2018年7月1日。

1.2 手術(shù)情況

該58例NSCLC患者根據(jù)術(shù)前檢查結(jié)果和術(shù)中探查情況進行了相應(yīng)的手術(shù)治療。術(shù)前檢查結(jié)果提示患者均能耐受肺部手術(shù)，手術(shù)方式為右上葉肺葉切除11例、右上葉肺楔形切除2例、右上肺葉支氣管袖式切除 2例、右上肺葉+右中肺葉切除1例、右中肺葉切除5例、右中葉肺楔形切除1例，右中肺葉+右下肺葉切除2例、右下肺葉切除4例、右全肺切除1例、左上肺葉切除14例、左上肺葉楔形切除2例、左上肺葉支氣管袖式切除1例、左下肺葉切除5例、左下肺葉楔形切除 2例、左下肺葉切除+左上葉肺楔形切除 1例和左全肺切除4例。術(shù)后根據(jù)2017年12月IASLC(國際肺癌研究協(xié)會)發(fā)布的第8版TNM分期進行病理分期。其中Ia期10例、Ib期11例、IIa期7例、IIb期6例、IIIa期13例、IIIb期9例、IV期2例。

1.3 實驗儀器和材料

倒置熒光顯微鏡(XDS-100 上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)、通風(fēng)櫥、微波爐。材料：移液器(P1，P200，P20，P10，GILSONl:4415678，eppendorf):吸頭(10 μL ，100 μL ，1 000 μL ，Axygen)。試劑：胎牛血清(10099-141 Invitrogen)，1mol/L的TBS緩沖液，0.01M mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB，pH6.0，1 000 mL)：檸檬酸三鈉3 g，檸檬酸0.4 g，3% H2O2溶液。一抗：PSMC2 (ab3322)，二抗：goat anti-Rabbit IgG-HRP均來之Abcam。

1.4 方法

取癌組織及癌旁正常組織石蠟標(biāo)本，常規(guī)進行組織切片。脫蠟前，將組織切片在60℃恒溫箱中烘烤30 min，置于二甲苯中浸泡30 min,二甲苯∶乙醇=1∶1混液中浸泡10 min,75%～95%乙醇浸泡,蒸餾水浸泡,室溫封閉?？乖迯?fù)：在微波爐里高火加熱以0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至沸騰后將組織切片放入，低火維持20 min，待自然冷卻至室溫后，置入蒸餾水浸泡10 min，10%血清(TBS配置)封閉30 min，吸棄血清，加入對應(yīng)一抗孵育過夜后回收一抗，TBS洗2遍后加入二抗，室溫孵育60 min后再以TBS洗滌。加入VULCAN FAST RED CHROMOGEN kit2染色15 min后再加入DAB染色，直至顯淺黃色位為止，放入蒸餾水中終止反應(yīng)，蘇木素染色30 s，放入蒸餾水中終止反應(yīng)，然后依次以乙醇和二甲苯脫水封片，晾干后觀察結(jié)果。

1.5 免疫組化結(jié)果及判定

根據(jù)陽性細胞數(shù)量和著色強度依次分為 “-、+、++和+++”,其中著色為“-”13例(22.41%)，著色為“+”19例(32.76%)，著色為“++”16例(27.59%)，著色為“+++”10例(17.24%)。以上結(jié)果顯示PSMC2在多數(shù)非小細胞患者的細胞中表達呈陽性(45/58，77.59%)，蛋白主要定位于細胞質(zhì)。以免疫染色作為分組依據(jù)，將染色結(jié)果為“-～+”定義為PSMC2表達陰性，將染色結(jié)果為“++～+++”定義為PSMC2陽性[5]，隨后進行兩組之間的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用t檢驗，計數(shù)資料用卡方檢驗。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，對于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以Mann-Whitney和Kruskal-Wallis方法進行檢驗，同時對生存狀況[(總生存率overall survival，OS)和無疾病進展時間(progression-free survival，PFS)]以Kaplan-Meier方法進行統(tǒng)計分析，以Logisitic回歸分析PSMC2的表達與臨床病理特征的關(guān)系，COX方法進行單因素和多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者在一般臨床資料方面的比較

PSMC2陰性患者與陽性患者的性別構(gòu)成(P=0.391)和年齡(P=0.743)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但PSMC2陽性患者中的吸煙者多于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035)，提示吸煙與PSMC2陽性可能存在一定的關(guān)聯(lián)。腫瘤生長部位、胸膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后病理分期上，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，腫瘤最大直徑和腫瘤分化程度上PSMC2陰性組與PSMC2陽性組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般臨床資料Table 1. Clinical Data of Patients in Two Groups

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2.2 PSMC2的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)58例患者的PSMC2標(biāo)本表達結(jié)果與臨床病理特點進行Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)PSMC2陽性表達僅與腫瘤分化程度有關(guān)(P=0.004)，余未見明顯相關(guān)(表2)。

表2 Logistic回歸分析PSMC2表達與臨床病理特征關(guān)系Table 2. Relationship between PSMC2 Expression and Clinicopathological Characteristics by Logistic Regression

2.3 兩組患者的生存分析

在OS上,PSMC2陰性組比PSMC2陽性組具有明顯的生存優(yōu)勢(P=0.004)，見圖1。PSMC2陰性組中位OS為62個月，PSMC2陽性組中位生存時間為56個月(HR0.271，95%CI：0.111～0.662)。在PFS上,PSMC2陰性組比PSMC2陽性組具有明顯的生存優(yōu)勢(P=0.043)，見圖2。PSMC2陰性組的中位PFS為48個月，PSMC2陽性組中位PFS為45個月(HR 0.421，95%CI0.182～0.975)。

圖1 兩組患者的OS曲線Figure 1. Overall Survival in the PSMC2-Negative Group and the PSMC2-Positive Group

圖2 兩組患者的PFS曲線Figure 2. Progression-Free Survival in the PSMC2-Negative Group and the PSMC2-Positive Group

單因素分析表明PSMC2陽性表達與OS相關(guān)(HR:2.952,CI:1.335～6.525;P=0.007)，另外腫瘤的分化程度也與OS相關(guān)(HR:2.046,CI:1.210～3.461;P=0.008)，見表3。進一步多因素分析發(fā)現(xiàn)，僅PSMC2與OS相關(guān),或可作為獨立的預(yù)后因子(HR:3.165,CI:1.439～6.961;P=0.004)。

表3 COX單因素分析Table 3. Univariate Analysis of the Correlation between PSMC2 Expression and Overall Survival of Non-small Cell Lung Cancer Patients

3 討 論

人體內(nèi)的正常細胞在各種相關(guān)基因的調(diào)控下，按照一定的規(guī)則和節(jié)奏進行生長、分裂和死亡。一旦細胞周期順序發(fā)生異常，就有可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6]。細胞周期的正常運行需要通過一系列的蛋白激酶來實現(xiàn)，而這些蛋白激酶又被稱之為細胞周期素依賴蛋白(cyclin-dependent kinases，CDK)，這是因為只有結(jié)合了細胞周期素(cycling)的蛋白激酶才具有真正的生物活性，才能推動細胞周期的進行。一旦細胞周期素本身發(fā)生代謝異常，不能被正常的降解，就會長時間地與CDK結(jié)合，而所形成的cyclin-CDK復(fù)合物，通過CDK活性，將有可能對不同底物磷酸化持續(xù)保持相應(yīng)的生物活性，而導(dǎo)致細胞周期的紊亂[7-8]。

研究發(fā)現(xiàn)細胞周期素的降解是通過與泛素結(jié)合后再遞呈給26S蛋白酶體復(fù)合物(26S proteasome)進行識別和降解。26S蛋白酶體復(fù)合物是由一個桶形20s核心顆粒和一個或兩個19s調(diào)節(jié)顆粒組成的復(fù)合體[9]。而19s調(diào)節(jié)顆粒是由6個ATP酶(PSMC1、PSMC2、PSMC3、PSMC4、PSMC5、PSMC6)組成的一個亞群，其結(jié)構(gòu)相似，在進化過程中高度保守[10]。從分子組成結(jié)構(gòu)上看PSMC2是構(gòu)成26S蛋白酶體中的19S調(diào)節(jié)亞單位的結(jié)構(gòu)之一，它的主要功能是利用ATP水解提供能量，對切掉泛素鏈的蛋白質(zhì)底物進行去折疊并轉(zhuǎn)運至20S核心顆粒中進行降解[11]，因此PSMC2的變化影響了26S蛋白酶體對cyclin的降解程度從而影響到了細胞周期的正常運行而引發(fā)腫瘤的產(chǎn)生[12-16]。由于26S蛋白酶體與腫瘤發(fā)生有關(guān)的細胞蛋白上起著關(guān)鍵作用，臨床上它被作為靶向目標(biāo)而對癌癥進行治療[17-21]。

既往已有報道PSMC2蛋白在骨肉瘤患者體內(nèi)表達并且驗證了其對骨肉瘤細胞的作用[22]:也有研究報道在40例I～III期胰腺癌患者中有28例患者PSMC2陽性，而同時收集的5例慢性胰腺炎患者均為PSMC2陰性[3]:另外有報道指出在96例結(jié)腸癌患者中有51例患者PSMC2高表達，而45例患者為PSMC2低表達，同時73例對照的癌旁組織PSMC2均為低表達[4]，以上這些結(jié)果均提示PSMC2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而對于PSMC2在肺癌患者中的表達情況尚未有報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)NSCLC細胞肺癌患者中PSMC2蛋白也具有不同程度的陽性表達，其陽性表達主要是集中在細胞質(zhì)中。我們依據(jù)PSMC2染色陽性程度強弱不等將這些病例分為了PSMC2表達陰性組和PSMC2表達陽性組，并進一步根據(jù)分組的不同比較這兩組患者在一般臨床資料和腫瘤相關(guān)資料上的差異。我們的研究結(jié)果顯示PSMC2陰性組患者與PSMC2陽性組患者在男女性別構(gòu)成上、年齡分組上、腫瘤類型、腫瘤生長的位置和部位、胸膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型和病理分期上均無顯著差異，提示以上這些方面與PSMC2的表達無相關(guān)。但是在吸煙、腫瘤的分化程度和腫瘤最大直徑上，兩組患者的結(jié)果卻出現(xiàn)了顯著差異，提示PSMC2的表達可能跟這些臨床病理參數(shù)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PSMC2陽性組中的吸煙者顯著多于PSMC2陰性組，且吸煙指數(shù)越高，PSMC2陽性者的占比就越大。眾所周知，吸煙是肺癌的高危因素。煙草中的多種有害物質(zhì)可能通過敏感基因激活、DNA損傷修復(fù)功能的降低等方面引發(fā)肺癌的發(fā)生和發(fā)展，同時煙草長期對肺組織的破壞會造成慢性炎癥和局部組織的缺氧環(huán)境，而體內(nèi)的缺氧會造成高缺氧區(qū)和體內(nèi)低氧分壓狀態(tài)又促進了血管生成因子的分泌增加，形成腫瘤生長和存活[5,23]。但吸煙是怎樣造成PSMC2表達的增強，是煙草內(nèi)成分本身激活還是通過其他因素促進其表達，則需要進一步的實驗研究來確定。

腫瘤的最大直徑和腫瘤的分化程度體現(xiàn)了腫瘤惡性程度的高低。本研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤分化的方面，隨著腫瘤的分化程度越差，PSMC2陽性患者人數(shù)占比也隨之增高，提示隨著PSMC2的陽性與NSCLC的惡性程度可能有關(guān)聯(lián)。同樣的我們發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤直徑的不斷增大，PSMC2陽性患者所占人數(shù)比例也隨之提高。該結(jié)果提示PSMC2的陽性表達與非小細胞肺癌的惡性程度密切相關(guān)，是NSCLC惡性程度的重要標(biāo)記，同時PSMC2的高表達與癌細胞的增殖有關(guān)，可能是癌細胞增殖的重要基因。我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤的最大直徑超過7 cm時，PSMC2陽性患者所占比例并沒有進一步提高，可能是因為腫瘤過大后出現(xiàn)細胞壞死，從而影響到PSMC2陽性的表達率。而進一步Logistic回歸分析結(jié)果僅顯示出PSMC2的表達與腫瘤的分化程度有關(guān)，而與腫瘤的直徑大小無關(guān)，提示PSMC2可能在腫瘤的分化程度中起作用。

本研究還發(fā)現(xiàn),無論在OS還是在PFS上，PSMC2陰性患者與PSMC2陽性患者的生存曲線均出現(xiàn)明顯差異，PSMC2陰性組患者的生存情況顯著優(yōu)于PSM2陽性患者，提示PSMC2的陽性表達是NSCLC患者不良預(yù)后的標(biāo)志。而在其他研究發(fā)現(xiàn)對于96例腸癌患者中比較了PSMC2表達陽性與表達陰性的生存差異，發(fā)現(xiàn)PSMC2陰性患者要好于PSMC2患者(P=0.009)[4]，而在骨肉瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)PSMC2陽性與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[21]，而針對靶向PSMC2的miR-630研究發(fā)現(xiàn),低表達的miR-630導(dǎo)致PSMC2表達增高，并導(dǎo)致患者生存低于因miR-630高表達而PSMC2表達降低患者[24]。COX單因素分析顯示PSMC2陽性表達和腫瘤的分化程度與患者的不良預(yù)后有關(guān)，而進一步的多因素分析顯示PSMC2是獨立的患者預(yù)后相關(guān)因素，其陽性表達與NSCLC的不良預(yù)后相關(guān)，有望成為NSCLC不良預(yù)后結(jié)局的潛在分子標(biāo)志物。

總之，我們的初步研究發(fā)現(xiàn)PSMC2在NSCLC患者體內(nèi)也有不同程度的表達，并且這種表達與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，同時PSMC2表達陽性的患者具有不良的生存預(yù)后，提示我們可以將其作為輔助診斷和判斷預(yù)后的標(biāo)志，積極研究其可能參與的信號通路而從中干預(yù)，可能會改善這一部分患者的預(yù)后。

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