miRNA-409-3p/Beclin-1信號軸在小細胞肺癌化療耐藥的作用及分子機制研究*

韓忠誠，蘇瑩，張玲玲，柳江，徐騰飛

830000 烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 腫瘤科(韓忠誠、蘇瑩、張玲玲、柳江);848000 新疆 和田，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮山醫(yī)院 全科醫(yī)療科(徐騰飛)

肺癌是目前世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共健康衛(wèi)生問題。小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)約占所有確診肺癌的17%，其惡性程度高，轉(zhuǎn)移速度快，患者5年生存率低于10%[1]。目前，化療依舊是SCLC治療的重要手段，而依托泊苷(VP16)和順鉑(DDP)的藥物聯(lián)合(VP16-DDP)則是臨床應(yīng)用最廣的化療方案[2]。臨床研究顯示，SCLC患者在治療期間耐藥速度快，且耐藥患者早期復(fù)發(fā)率高，5年生存率低于5%[3]。因此，探究SCLC對VP16-DDP的耐藥機制，提高VP16-DDP的治療效果，是臨床亟待解決的重要問題。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)。例如，申利等[4]發(fā)現(xiàn)miRNA-409-3p可增加宮頸癌對DDP化療的敏感性；Cheng等[5]發(fā)現(xiàn)miRNA-409-3p通過阻斷Fip200介導(dǎo)的自噬，增強卵巢癌細胞對DDP的化療敏感性。這些研究提示，miRNA-409-3p與腫瘤自噬及化療耐藥密切相關(guān)。但miRNA-409-3p在SCLC細胞自噬及耐藥機制中的作用尚未見報道。Tan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-409-3p通過靶向Beclin-1影響結(jié)腸癌細胞的自噬作用和對奧沙利鉑的藥物敏感性。Beclin-1是哺乳動物特有的自噬相關(guān)蛋白，包括N端BH3結(jié)構(gòu)域、中心卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain,CCD)和進化保守結(jié)構(gòu)域(evolutionarily conserved domain,ECD)。其中CCD域可與Beclin-1調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因中的激活分子相互作用，而ECD和CCD域則與Beclin-1下游通路PI3KC3/Vps15相互作用，以此調(diào)控腫瘤的自噬及發(fā)生發(fā)展[7]。研究顯示，Beclin-1在耐藥SCLC細胞中表達顯著增高[8]，且DDP治療后Beclin-1表達上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤細胞自噬活性增強，進而提高了腫瘤細胞的耐藥性[9]。這說明Beclin-1與SCLC細胞的耐藥密切相關(guān)。因此，本研究通過探究miRNA-409-3p與Beclin-1在VP16-DDP耐藥SCLC細胞中的表達，闡明miRNA-409-3p與Beclin-1的靶向關(guān)系及SCLC的耐藥機制，以期為克服SCLC耐藥提供實驗參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本、細胞株及主要試劑

15例耐藥腫瘤組織樣本和15例藥物敏感性腫瘤組織樣本，均來自我院于2017年5月至2019年5月收治的SCLC病例。所有患者均以4～8療程EP方案化療為主(VP16：100 mg/m2,DDP：60 mg/m2)。SCLC患者根據(jù)RECIST 1.1實體瘤療效判定標(biāo)準(zhǔn)判斷治療敏感性：完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response,PR)、穩(wěn)定(stable disease,SD)和進展(progressive disease,PD)?；熃Y(jié)束6個月后，判定化療效果。VP16-DDP化療敏感患者是化療結(jié)束后6個月未出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)(CR+PR+SD)；VP16-DDP化療耐藥患者為腫瘤在化療過程中出現(xiàn)進展，或化療結(jié)束后6個月出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。所有患者年齡在45～65歲，其中男性23例，女性7例。術(shù)后病理診斷皆為SCLC，術(shù)前未行化療或放療，且所有患者均已簽署知情同意書。本研究試驗獲得本院倫理委員會的批準(zhǔn)(批號：KY2019051518)。組織樣本均保存于-80℃。人SCLC細胞系SBC-5購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。Trizol試劑購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。GFP-LC3慢病毒質(zhì)粒購自上海興拓生物醫(yī)藥科技有限公司。mimic NC和miRNA-409-3p mimic由Genepharma公司合成。pcDNA3.1質(zhì)粒購自云舟生物科技有限公司。LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。CCK8檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。BCA 蛋白定量試劑盒購自中國晶彩生物科技有限公司。雙熒光素酶活性檢測試劑盒北京平皓生物技術(shù)有限公司。Beclin-1抗體、LC3I、LC3II、P26、PI3KC3和Vpsl5抗體購自Abcam公司，二抗(羊抗兔)購自美國CST公司。3-MA(PI3KC3抑制劑)購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

SBC-5細胞用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人SCLC VP16-DDP耐藥細胞株為本課題組采用逐步升高藥物濃度的方法構(gòu)建：體外逐步增加VP16(初始作用濃度：0.05 μg/mL)與DDP(初始作用濃度：0.01μg/mL)維持作用濃度 ，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)SBC-5細胞13個月，VP16-DDP耐藥的SBC-5細胞可穩(wěn)定耐受1.5 μg /mL的VP16和1.25 μg /mL的DDP。耐藥細胞命名為SBC-5/EP，與親本細胞相對應(yīng)。SBC-5/EP細胞用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d更換培養(yǎng)基，并加入相應(yīng)濃度藥物。將Beclin-1基因序列克隆進入pcDNA3.1載體。SBC-5/EP細胞轉(zhuǎn)染前一天胰酶消化計數(shù)，以每孔3.5×106個SBC-5/EP細胞接種于6孔板內(nèi)過夜培養(yǎng)。根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將40 ng的miRNA-409-3p mimic(mimic組)、mimic NC(mimic NC組)分別轉(zhuǎn)染SBC-5/EP細胞，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基。將45 ng的pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-Beclin-1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SBC-5/EP細胞(已轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic)，分別標(biāo)記為mimic pc組和mimic-pc-Beclin-1組，將轉(zhuǎn)染的細胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。將5 mM的3-MA作用mimic-pc-Beclin-1組細胞20 h，更換新鮮培養(yǎng)基，標(biāo)記為mimic-pc-Beclin-1-3-MA組。

1.3 qRT-PCR

Trizol試劑提取細胞的RNA，紫外分光光度計檢測RNA含量。反轉(zhuǎn)錄實驗流程根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明進行。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行qRT-PCR檢測，反應(yīng)體系為：cDNA模板2 ng，上下游引物各0.4 μL(表1)，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，ddH2O補充至10 μL。擴增結(jié)果根據(jù)2-△△Ct法計算miRNA-409-3p和Beclin-1 mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1. Primer Sequences in qRT-PCR

1.4 Western blot

蛋白提取裂解液裂解細胞，利用BSA法檢測細胞蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白后轉(zhuǎn)膜。利用5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，加鼠抗人的Beclin-1、LC3I、LC3II、P62、PI3KC3和Vps15抗體(1∶3000)搖床4℃孵育過夜，TBST洗膜5 min，4次，加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗(1∶2 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5 min，4次。顯影曝光，通過Image-Pro Plus系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

1.5 克隆形成實驗

胰酶消化細胞，完全培養(yǎng)基重懸細胞后計數(shù)。以每孔1 000個細胞接種于6孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)基并觀察細胞，且在6孔板底部對單克隆細胞標(biāo)記。培養(yǎng)9天后觀察細胞，棄上清，PBS洗滌細胞2次，加入1 mL 4%多聚甲醛，4℃固定細胞1 h，PBS洗滌細胞3次，加入1 000 μL結(jié)晶紫染色液作用細胞2 min，ddH2O洗滌細胞3次，晾干后拍照且計數(shù)。

1.6 熒光素酶活性分析實驗

Beclin-1的3’UTR WT/MUT分別克隆至熒光素酶報告載體pmirGLO載體。miRNA-409-3p mimic和mimic NC分別與pmirGLO-Beclin-1-WT或pmirGLO-Beclin-1-MUT共轉(zhuǎn)染HuH-6細胞。48 h后收取處理細胞，通過熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶的活性。

1.7 GFP-LC3綠色熒光融合蛋白實驗

慢病毒GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞24 h，PBS洗滌細胞3次，3.7%的甲醛中固定20 min,PBS洗滌3次，甘油固定細胞，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光斑點。

1.8 流式細胞術(shù)

將轉(zhuǎn)染細胞胰酶消化離心，收集細胞后預(yù)冷的PBS洗滌細胞。避光條件下，加入FITC-Annexin V和碘化丙鈉，靜置15 min，加入Binding Buffer混勻置于冰上，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.9 MTT實驗

胰酶消化SBC-5細胞、未轉(zhuǎn)染的SBC-5/EP細胞和已轉(zhuǎn)染的SBC-5/EP細胞，培養(yǎng)基重懸細胞計數(shù)。以3×104個/孔接種至96孔板，待細胞生長融合至65%時，按1.2方法進行細胞轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL 的MTT溶液，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄上清，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶物溶解。置于自動酶標(biāo)儀內(nèi)，檢測在490 nm波長的吸光度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行分析，實驗均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)表示均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用GraphPad Prism 6軟件制圖。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-409-3p和Beclin-1在VP16-DDP耐藥SCLC組織和SCLC細胞SBC-5細胞中的表達情況

qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，VP16-DDP耐藥的SCLC組織中miRNA-409-3p的表達顯著低于VP16-DDP敏感的SCLC組織(P<0.01)，見圖1A；VP16-DDP耐藥的SCLC組織中Beclin-1的表達顯著高于VP16-DDP敏感的SCLC組織(P<0.01)，見圖1B。我們建立了VP16-DDP耐藥的SBC-5細胞(SBC-5/EP)。SBC-5/EP細胞中miRNA-409-3p的表達顯著低于SBC-5細胞(P<0.05)，見圖1C；SBC-5/EP細胞中Beclin-1的表達顯著高于SBC-5細胞(P<0.05)，見圖1D。Western blot實驗結(jié)果顯示，SBC-5/EP細胞中Beclin-1的蛋白表達水平顯著高于SBC-5細胞(P<0.05)，見圖1E。

圖1 miRNA-409-3p和Beclin-1在耐藥小細胞肺癌組織和耐藥SBC-5/EP細胞系中的表達Figure 1. Expression of miRNA-409-3p and Beclin-1 in Drug-Resistant Small Cell Lung Cancer and Drug-Resistant SBC-5/EP Cell LineA. Expression of miRNA-409-3p in drug-resistant small cell lung cancer and drug-sensitive small cell lung cancer (compared with drug-sensitive small cell lung cancer, **P<0.01); B. Expression of Beclin-1 in drug-resistant small cell lung cancer and drug-sensitive small cell lung cancer (compared with drug-sensitive small cell lung cancer, **P<0.01); C. Expression of miRNA-409-3p in drug-resistant SBC-5/EP cell line and drug-sensitive SBC-5/EP cell line (compared with the SBC-5 cell, △P<0.05); D. Expression of Beclin-1 in drug-resistant SBC-5/EP cell line and drug-sensitive SBC-5/EP cell line (compared with SBC-5 cell, △P<0.05); E. The level of Beclin-1 protein in drug-resistant SBC-5/EP cell line and drug-sensitive SBC-5/EP cell line (compared with the SBC-5 cell, @P<0.05).

2.2 SBC-5/EP細胞自噬作用增強

Western blot實驗結(jié)果顯示，SBC-5/EP細胞中的LC3II/LC3I的比值升高，P62蛋白表達顯著低于SBC-5細胞(P<0.01)，見圖2A。MTT檢測結(jié)果顯示，SBC-5/EP細胞的IC50值明顯高于SBC-5細胞(P<0.05)，見圖2B。GFP-LC3綠色熒光融合蛋白實驗顯示，SBC-5細胞中出現(xiàn)綠色斑點，而SBC-5/EP細胞中出現(xiàn)明亮的綠色熒光小點，表明SBC-5/EP細胞自噬增強，見圖2C?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，SBC-5/EP細胞的增殖能力顯著高于SBC-5細胞(P<0.05)，見圖2D。

圖2 VP16-DDP耐藥的SBC-5細胞自噬作用增強Figure 2. Enhanced Autophagy in VP16-DDP-Resistant SBC-5 CellsA. Western blot was used to detect the effect of VP16-DDP on autophagy-related protein LC3I, LC3II and P62 (compared with the SBC-5 cell, **P<0.01); B. MTT assay was used to detect the effect of VP16-DDP on cell viability (compared with the SBC-5 cell, △P<0.05); C. GFP-LC3 dot formation was used to detect the effect of VP16-DDP on punctate GFP+ cells; D. Colony formation assay was used to detect the effect of VP16-DDP on cell proliferation (compared with the SBC-5 cell, @P<0.05).

2.3 miRNA-409-3p靶向抑制Beclin-1的表達

通過將miRNA-409-3p mimic和mimic NC分別轉(zhuǎn)染SBC-5/EP細胞，檢測miRNA-409-3p對Beclin-1表達的影響。qRT-PCR及Western blot實驗結(jié)果顯示，與mimic NC相比，miRNA-409-3p抑制Beclin-1 mRNA和蛋白的表達(P<0.05)，見圖3A、3B。通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan進行生物學(xué)信息預(yù)測，結(jié)果顯示miRNA-409-3p與Beclin-1 mRNA的3’UTR之間存在互補配對序列，見圖3C。為了證實miRNA-409-3p靶向調(diào)控Beclin-1表達，構(gòu)建Beclin-1野生型及突變型質(zhì)粒進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，結(jié)果顯示與mimic NC組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic的野生型組SBC-5/EP細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而較轉(zhuǎn)染miRNA-409-3p mimic的突變型組SBC-5/EP細胞的熒光素酶活性無顯著改變，見圖3D。

圖3 miRNA-409-3p靶向抑制Beclin-1的表達Figure 3. Inhibition of Beclin-1 via Targeted miRNA-409-3pPanel A and B show miRNA-409-3p mimic and miRNA-409-3p NC transfected SBC-5/EP cell, respectively. Total RNA and cell lysates were extracted at 24 hours after transfection and were used to detect the expression of Beclin-1 at both mRNA and protein levels by qRT-PCR and western blot (compared with mimic NC, **P < 0.05). Panel C shows the binding site between miRNA-409-3p and Beclin-1 predicted by TargetScan. In panel D, luciferase activity assay demonstrated that miRNA-409-3p targeted Beclin-1’s 3’UTR-WT (compared with the wild-type SBC-5/EP cell in the mimic NC group, **P < 0.01).

2.4 miRNA-409-3p抑制自噬調(diào)節(jié)SBC-5/EP細胞對VP16-DDP的耐藥性

Western blot實驗結(jié)果顯示，與mimic NC相比，miRNA-409-3p mimic組的LC3II/LC3I的比值降低，P62蛋白表達升高(P<0.01)，見圖4A。GFP-LC3綠色熒光融合蛋白實驗顯示，與mimic NC相比，miRNA-409-3p mimic組的SBC-5/EP細胞出現(xiàn)綠色熒光斑點，表明自噬降低，見圖4B。克隆形成實驗結(jié)果顯示，與mimic NC相比，miRNA-409-3p mimic抑制SBC-5/EP細胞的增殖(P<0.05),見圖4C；流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與mimic NC相比，miRNA-409-3p mimic促進SBC-5/EP細胞凋亡，見圖4D；Western blot實驗結(jié)果顯示，與mimic NC相比，miRNA-409-3p mimic促進SBC-5/EP細胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9表達(P<0.05)，見圖4E。MTT實驗結(jié)果顯示，與mimic NC相比，miRNA-409-3p mimic降低了SBC-5/EP細胞的的IC50值(P<0.05)，見圖4F。

圖4 miRNA-409-3抑制SBC-5/EP細胞的自噬對VP16-DDP耐藥性的影響Figure 4. Effect of miRNA-409-3p on Drug Resistance of VP16-DDP by Inhibiting Autophagy of SBC-5/EP CellsA. Effect of miRNA-409-3p on autophagy-related proteins (LC3II and P62) detected by Western blot (compared with mimic NC, **P<0.01); B. Effect of miRNA-409-3p on punctate GFP+ cells detected by GFP-LC3 dot formation; C. Effect of miRNA-409-3p on cell proliferation detected by colony formation assay (compared with mimic NC, △P < 0.05); D. Effect of miRNA-409-3p on apoptosis detected by flow cytometry; E. Expressions of apoptotic proteins (caspase-3 and caspase-9) analyzed by Western blot (compared with mimic NC, @P<0.05); F. Effect of miRNA-409-3p on cell viability detected by MTT assay (compared with mimic NC, &P<0.05).

2.5 miRNA-409-3p/Beclin-1對SBC-5/EP細胞的自噬和VP16-DDP耐藥性的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，與mimic pc相比，mimic pc-Beclin-1組LC3II/LC3I的比值升高，P62蛋白表達降低(P<0.05)，見圖5A。GFP-LC3綠色熒光融合蛋白實驗顯示，與mimic pc相比，mimic pc-Beclin-1組的SBC-5/EP細胞中出現(xiàn)明亮的綠色熒光小點，表明自噬增強，見圖5B?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，與mimic pc相比，mimic pc-Beclin-1促進SBC-5/EP細胞的增殖(P<0.05)，見圖5C。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與mimic pc相比，mimic pc-Beclin-1抑制SBC-5/EP細胞凋亡，見圖D；Western blot實驗結(jié)果顯示，與mimic pc相比，mimic pc-Beclin-1抑制SBC-5/EP細胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的表達(P<0.05)，見圖E。MTT實驗結(jié)果顯示，與mimic pc相比，mimic pc-Beclin-1提高了SBC-5/EP細胞對VP16和DDP的耐藥性(P<0.05)，見圖5F。

2.6 miRNA-409-3p/Beclin-1對SBC-5/EP細胞的PI3KC3/Vpsl5信號通路的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，與mimic NC相比，miRNA-409-3p mimic抑制SBC-5/EP細胞中的PI3KC3和Vpsl5蛋白的表達(P<0.05)；與mimic pc相比，mimic pc-Beclin-1促進SBC-5/EP細胞中的PI3KC3和Vpsl5蛋白的表達(P<0.05)；與mimic pc-Beclin-1組相比，mimic pc-Beclin-1-3-MA可抑制SBC-5/EP細胞中的PI3KC3和Vpsl5蛋白的表達，見圖6。

3 討 論

肺癌是死亡率最高的惡性腫瘤之一，其組織學(xué)類型分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和SCLC。與NSCLC相比，SCLC具有較高核質(zhì)比，且核染色質(zhì)顆粒細小[10]。臨床研究顯示，SCLC患者發(fā)生癌細胞的轉(zhuǎn)移幾率較高，且SCLC的病理特征與臨床結(jié)果之間的關(guān)系復(fù)雜，致使SCLC的治療進展緩慢[11]。目前，化療仍然是SCLC治療策略的基礎(chǔ)。其中VP16+DDP是SCLC治療的一線化療藥物[2]。但臨床研究顯示，由于耐藥性的出現(xiàn)，接受二次化療的患者治療效果并不理想。而且不同患者在臨床表現(xiàn)、預(yù)后、治療反應(yīng)、耐受性等方面存在個體差異，導(dǎo)致化療耐藥表型形成的機制尚不明確[12]。因此，尋找VP16-DDP的耐藥機制一直是SCLC研究領(lǐng)域的熱點。

研究顯示，耐藥機制包括多種因素，例如多藥耐藥蛋白家族的調(diào)控、細胞凋亡、自噬、細胞內(nèi)藥物代謝酶系統(tǒng)、腫瘤干細胞、miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、穩(wěn)態(tài)變化、DNA損傷修復(fù)等表觀遺傳調(diào)控[13]。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Etk與PFKFB4的相互作用可調(diào)節(jié)自噬，從而影響調(diào)節(jié)小細胞肺癌的化療耐藥性；Yu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過促進細胞自噬和凋亡，可逆轉(zhuǎn)小細胞肺癌細胞的化療耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，VP16-DDP耐藥的SCLC細胞SBC-5自噬活性增強，導(dǎo)致耐藥的SBC-5細胞的增殖能力提高，細胞凋亡能力降低，對VP16-DDP的敏感性降低。這說明，SBC-5細胞的VP16-DDP耐藥機制可能與細胞自噬相關(guān)。

自噬是化療后維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的促生存反應(yīng)，與多種癌癥的耐藥發(fā)展相關(guān)[16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可改變SCLC細胞的自噬及凋亡，進而影響SCLC對化療藥物的敏感性。例如，張云等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b在多藥耐藥細胞株H69AR中呈低表達，上調(diào)其表達通過改變H69AR細胞的自噬，降低細胞對ADM、DDP和 VP-16等化療藥物的耐藥性；申利等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-409-3 p與宮頸癌細胞增殖及順鉑化療敏感性相關(guān)；Cheng等[5]發(fā)現(xiàn)miRNA-409-3p通過調(diào)控卵巢癌細胞自噬，影響腫瘤細胞對DDP的化療敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-409-3p在VP16-DDP耐藥的SCLC組織和SBC-5細胞中低表達，上調(diào)miRNA-409-3p可抑制SBC-5/EP細胞自噬，促進SBC-5/EP細胞的凋亡，抑制SBC-5/EP細胞的增殖，提高SBC-5/EP細胞對VP16-DDP的藥物敏感性，表明miRNA-409-3p可通過抑制自噬增加SBC-5/EP細胞對VP16-DDP的敏感性。最新研究顯示，miRNA-409-3p靶向Fip200可調(diào)節(jié)卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[5]，miRNA-409-3p靶向Beclin-1介導(dǎo)的自噬使結(jié)腸癌細胞對奧沙利鉑敏感[18]。這些研究提示，miRNA-409-3p可通過靶向mRNA，影響腫瘤細胞的藥物敏感。本研究結(jié)果顯示，miRNA-409-3p可靶向抑制Beclin-1的表達。

Beclin-1是自噬調(diào)控的核心分子，分布在細胞質(zhì)膜、細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1與肺腺癌的DDP耐藥性相關(guān)[20]；沉默Beclin-1基因可增加人肺癌細胞A549對DDP的敏感性，促進細胞凋亡[21]。這些研究提示，Beclin-1在腫瘤細胞耐藥機制中扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1在VP16-DDP耐藥的SBC-5/EP中的高表達，且過表達Beclin-1可逆轉(zhuǎn)miRNA-409-3p對SBC-5/EP細胞自噬及VP16-DDP的藥物敏感性的影響。這說明，miRNA-409-3p通過Beclin-1調(diào)節(jié)SBC-5/EP細胞自噬及VP16-DDP的藥物敏感性。Kang等[7]研究顯示，Beclin-1通過與輔因子PI3KC3相互作用，調(diào)節(jié)脂質(zhì)激酶蛋白表達，促進Beclin-1/Vps15核心復(fù)合物的形成，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬。任爽等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1/PI3K信號通路與肺癌的阿霉素耐藥性相關(guān)。這些研究提示，Beclin-1/PI3KC3/Vps15信號通路可能參與調(diào)控腫瘤細胞的自噬與耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Beclin-1可逆轉(zhuǎn)miRNA-409-3p對PI3KC3/Vps15信號通路蛋白的抑制作用，且通路蛋白抑制劑3-MA可改變miRNA-409-3p/Beclin-1軸對PI3KC3/Vps15信號通路蛋白的影響。這不僅表明Beclin-1/PI3KC3/Vps15信號通路與小細胞肺癌的VP16-DDP耐藥性相關(guān)，而且說明miRNA-409-3p負向調(diào)控Beclin-1，可抑制PI3KC3/Vps15信號通路的激活。

綜上所述，本文初步探究了miRNA-409-3p與Beclin-1在VP16-DDP耐藥的SCLC中的作用，驗證了miRNA-409-3p與Beclin-1的靶向關(guān)系，以及通過靶向Beclin-1而調(diào)控SBC-5/EP細胞自噬及VP16-DDP的藥物敏感性。本研究不僅豐富了Beclin-1在SCLC的VP16-DDP耐藥機制中的作用，而且還為VP16-DDP耐藥SCLC的分子靶向治療和化療藥物敏感性研究提供了新的策略。

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