羅哌卡因?qū)π律笫竽X細(xì)胞凋亡以及學(xué)習(xí)能力的影響

李前輝，謝小娟，張宜林

我國(guó)每年有大量的嬰幼兒會(huì)接受麻醉及手術(shù)，麻醉及手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)嬰幼兒的影響一直是醫(yī)院和家長(zhǎng)關(guān)注的問題。諸多的臨床研究以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究顯示患者在術(shù)后及麻醉后出現(xiàn)認(rèn)知性的障礙均與麻醉藥物存在相關(guān)性[1-2]。麻醉藥物是目前公認(rèn)的能引起患者出現(xiàn)短時(shí)間認(rèn)知障礙的藥物[3]。羅哌卡因是臨床常用的局部麻醉藥物之一，被廣泛應(yīng)用于各種麻醉，特別是剖宮產(chǎn)和嬰幼兒小手術(shù)中[4-6]。羅哌卡因作為一種局部麻醉藥物，是否會(huì)對(duì)嬰幼兒認(rèn)知造成影響，目前報(bào)道較少。該研究以新生大鼠作為研究對(duì)象，分析了羅哌卡因?qū)π律笫髮W(xué)習(xí)認(rèn)知能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物120只出生10 d的新生大鼠購(gòu)自上海斯萊克生物有限公司，動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)：12910371116，大鼠飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料TNF-α和IL-1β細(xì)胞因子試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物有限公司；2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物有限公司；Bcl-2、Bax和Caspase-3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中山金橋生物有限公司；TUNEL染色試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理60只出生10 d的新生大鼠隨機(jī)分為3組，每組20只，即對(duì)照組、低劑量組和高劑量組。低劑量組和高劑量組分別采用微量注射器經(jīng)腹腔給予0.5%的羅哌卡因20 μl和60 μl，對(duì)照組注射60 μl的生理鹽水。在處理12 h后，60只新生大鼠全部處死，取血液和腦組織，進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。另取60只出生10 d的新生大鼠如上處理后29 d，采用水平迷宮實(shí)驗(yàn)分析學(xué)習(xí)記憶能力。

1.4 熒光定量PCR分析炎癥因子mRNA水平取腦組織0.1 g，勻漿后采用RNA提取試劑盒提取總RNA，并采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR模板。然后根據(jù)根據(jù)PSAT1基因的序列，設(shè)計(jì)如下引物：PSAT1：(F:5′-GGCCAGTTCAGTGCTGTCC-3′；R:5′-GCTCCTGTCACCACATAGTCA-3′)、GAPDH:(F:5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′；R:5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′)。制備RT-PCR體系：2×qPCR SYBR Green Mix 10 μl, 上游和下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，用水將體積補(bǔ)至20 μl。按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR：93 ℃, 3 min預(yù)變性；93 ℃,30 s變性；55 ℃,45 s退火延伸；72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。最后從實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上直接讀取數(shù)據(jù)，進(jìn)行定量分析。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子的水平新生大鼠在處理12 h后，取血液，在4 ℃靜置12 h，使血清分層，然后3 000 r/min離心5 min，收集血清。然后按照ELISA試劑盒操作說明書測(cè)定TNF-α和IL-1β的水平。

1.6 Western blot分析腦組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)取腦組織0.5 g，加入細(xì)胞裂解液，勻漿后，12 000 r/min離心20 min，然后將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，20 000 g離心1 h，收集細(xì)胞裂解上清，加入5×Loading buffer,在金屬浴中煮沸20 min, 然后進(jìn)行SDS-PAGE，起始電壓80 V。待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，將電壓調(diào)至120 V。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，NC膜用5%脫脂奶粉封閉30 min，結(jié)束后分別用5%脫脂奶粉稀釋Bcl-2、Bax、Caspase-3單克隆抗體，在4 ℃孵育12 h，結(jié)束后用PBST洗滌3次，每次5 min；再用5%脫脂奶粉稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，在室溫孵育30 min，然后PBST洗滌3次后，NC膜上滴加發(fā)光液后進(jìn)行掃描，分析蛋白條帶變化，并以β-actin作為內(nèi)參。

1.7 TUNEL檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡水平將各組大鼠腦組織切成3～5 μm的石蠟切片；將切片用二甲苯浸洗脫蠟，共2次，每次5 min；分別用100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗水化，每次3 min；3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min；TBS浸洗5 min；滴加Proteinase K溶液(濃度為20 μg/ml)，室溫孵育15 min；TBS浸洗5 min；配制TUNEL反應(yīng)混合物，滴加100 μl TUNEL反應(yīng)混合物，置于濕盒中，37 ℃避光孵育60 min；TBS浸洗2次，每次5 min；倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，觀察時(shí)采用40倍物鏡和10倍目鏡，隨機(jī)選取梗死區(qū)和周邊區(qū)域10個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例作為腦細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

1.8 Morris水平迷宮實(shí)驗(yàn)水平迷宮實(shí)驗(yàn)方法按Wen et al[6]方法進(jìn)行。主要測(cè)定不同處理大鼠平均逃避潛伏期，原平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間和穿越原平臺(tái)次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 羅哌卡因?qū)π律笫笱装Y因子的影響與對(duì)照組比較，羅哌卡因低劑量組和高劑量組大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β mRNA及血清中TNF-α和IL-1β 蛋白質(zhì)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量組比較，高劑量組大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β mRNA及血清中TNF-α和IL-1β 蛋白質(zhì)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 羅哌卡因?qū)π律笫笱装Y因子水平的影響

2.2 羅哌卡因?qū)π律笫竽X組織凋亡相關(guān)蛋白的影響與對(duì)照組比較，羅哌卡因低劑量組和高劑量組大鼠腦組織中凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白水平明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量組比較，高劑量組大鼠腦組織中凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白水平增加更為顯著，抗凋亡蛋白Bcl-2水平下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 羅哌卡因?qū)π律笫竽X組織凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.3 羅哌卡因?qū)π律笫竽X組織凋亡水平影響與對(duì)照組比較，羅哌卡因低劑量組和高劑量組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量組比較，高劑量組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡水平增加更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 羅哌卡因?qū)π律笫竽X組織細(xì)胞凋亡水平的影響

2.4 羅哌卡因?qū)π律笫髮W(xué)習(xí)記憶能力的影響與對(duì)照組比較，在第29～32天，低劑量組和高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，其中第31天和第32天，高劑量組逃避潛伏期高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組探索實(shí)驗(yàn)中原平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 羅哌卡因?qū)π律笫筇颖軡摲诘挠绊?/p>

表3 羅哌卡因?qū)π∈筇剿髂芰Φ挠绊?/p>

3 討論

羅哌卡因是單一對(duì)映結(jié)構(gòu)體長(zhǎng)效酰胺類局麻藥，其作用機(jī)制與其它局麻藥相似，通過抑制神經(jīng)細(xì)胞鈉離子通道，阻斷神經(jīng)興奮與傳導(dǎo)[7]。羅哌卡因被廣泛應(yīng)用于硬膜外麻醉如剖宮產(chǎn)術(shù)或者兒科手術(shù)，或者用于術(shù)后及分娩鎮(zhèn)痛等過程中[8-9]。但其是否會(huì)對(duì)分娩時(shí)胎兒或者嬰幼兒造成一定的不良反應(yīng)，目前報(bào)道很少。認(rèn)知障礙是麻醉類藥物常見的不良反應(yīng)。認(rèn)知是機(jī)體認(rèn)識(shí)和獲取知識(shí)的智能加工過程，它包括學(xué)習(xí)、記憶、語(yǔ)言、思維、精神、情感等一系列的心理和社會(huì)行為[10-11]。目前對(duì)于麻醉藥物對(duì)認(rèn)知的影響說法不一，有研究顯示麻醉藥物可以提高患者的認(rèn)知能力，有研究顯示麻醉藥物可降低患者的認(rèn)知能力。本研究在動(dòng)物水平上分析了羅哌卡因?qū)Υ笫髮W(xué)習(xí)認(rèn)知能力的影響。

為了模擬胎兒或者嬰幼兒，本研究選用出生后第7天大鼠作為研究模型。出生后第7天是嚙齒類動(dòng)物大腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的高峰時(shí)期，是研究藥物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)影響的最佳時(shí)期[12]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)被廣泛用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力分析[13]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低劑量組和高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，其中第31天和第32天，高劑量組逃避潛伏期高于低劑量組，說明羅哌卡因處理大鼠后會(huì)影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并隨著藥物劑量增加，影響水平也逐漸增強(qiáng)。在探索實(shí)驗(yàn)中，研究結(jié)果顯示，羅哌卡因?qū)υ脚_(tái)象限活動(dòng)時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)無影響，說明羅哌卡因?qū)Υ笫筇剿髂芰o影響。

在羅哌卡因處理大鼠后，可見大鼠炎癥因子的水平明顯增加，說明羅哌卡因可以誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。同時(shí)羅哌卡因?qū)е履X組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞凋亡比例明顯增加。上述結(jié)果說明羅哌卡因可以導(dǎo)致炎癥，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。值得注意的是，羅哌卡因?qū)?xì)胞炎癥和凋亡的影響相對(duì)較弱，但是對(duì)于新生大鼠而言，輕微的炎癥或者凋亡可能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元不具有增殖能力，一旦損傷可能會(huì)明顯降低信息傳遞的能力。

綜上所述，羅哌卡因?qū)π律笫竽X組織可產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。