魯中地區(qū)男性尖銳濕疣患者人乳頭瘤病毒基因亞型檢測(cè)的研究

戴永剛，魏家富，張艷麗，程世亮，李 萌，劉 昊，王 園，于 淼

尖銳濕疣（condyloma acuminate，CA）好發(fā)于生殖器及肛周部位，且容易復(fù)發(fā)，是目前常見(jiàn)的性傳播疾病之一，發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)[1]。人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是由約8 000 個(gè)堿基對(duì)雙鏈環(huán)狀DNA 和蛋白質(zhì)衣殼組成的無(wú)包膜的病毒，屬乳多空病毒科多瘤病毒亞科[2]。HPV 具有強(qiáng)嗜上皮性，感染后可導(dǎo)致人類皮膚和黏膜多種良性和惡性病變，男性感染HPV 后主要引起外生殖器和肛周疣[3,4]。目前已確定的HPV 亞型大約有200 多種，不同亞型的HPV 致病性存在很大差別。低危型 HPV 感染主要引起皮膚黏膜的良性增生，長(zhǎng)期病毒感染尤其是高危型HPV 病毒的持續(xù)性感染與宮頸癌和生殖器腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。高危型HPV 感染還可引起男性肛門(mén)癌、陰莖癌以及口腔癌[5,6]。

HPV 病毒基因型具有顯著區(qū)域差異，不同地區(qū)的主要致病基因型存在差異性，不同地區(qū)男性HPV亞型的感染率及各基因型的分布情況不盡相同[7]。魯中地區(qū)是山東省經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)的區(qū)域，對(duì)研究經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)男性HPV 感染的特征具有代表性，因此，獨(dú)立研究此地區(qū)的男性HPV 基因亞型及分布特征對(duì)預(yù)防和治療HPV 感染具有重要意義。筆者運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（PCR-RDB）對(duì)男性尖銳濕疣患者皮損組織進(jìn)行HPV 檢測(cè)，并對(duì)521 例HPV檢測(cè)陽(yáng)性者的基因分型的分布情況進(jìn)行分析，從而對(duì)其分子流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查及研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

2014 年1 月—2019 年12 月，筆者采集了魯中地區(qū)（包含濟(jì)南、萊蕪、東營(yíng)、淄博、泰安）各市醫(yī)院性病門(mén)診男性尖銳濕疣患者標(biāo)本，分別取自男性患者尖銳濕疣皮損部位的組織，包括尿道口、冠狀溝、肛周、包皮等處。采集的標(biāo)本立即放入專用樣本采集管（深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供的HPV23 分型細(xì)胞保存管）中，冷藏保存，并送往山東省立第三醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行HPV 檢測(cè)。HPV 檢測(cè)為陽(yáng)性者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.2 儀器與試劑

Veriti? Dx 熱循環(huán)儀（ABI，美國(guó)）、核酸雜交儀（深圳亞能生物技術(shù)有限公司）、HPV DNA 基因分型檢測(cè)試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司）、恒溫金屬干浴器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本采集與核酸提取 用試劑盒附帶的取樣拭子稍用力刮取患處皮損組織，放入專用的樣品保存管中，按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA 提取，在體系中加入提取好的DNA 模板5 μl 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)總體系25 μl 。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件 50 ℃ 15 min；95 ℃10 min；94℃ 10 s，42℃ 90 s，72℃ 30 s，共10 個(gè)循環(huán)；94℃ 10 s，46℃ 60 s，72℃ 20 s，共30 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增結(jié)束后95℃ 2 min 變性。

1.3.3 HPV 雜交 變性產(chǎn)物通過(guò)冰盒轉(zhuǎn)移到核酸雜交儀上進(jìn)行雜交、孵育和顯色。按實(shí)際說(shuō)明書(shū)和本實(shí)驗(yàn)室制定的SOP 文件進(jìn)行雜交顯色及判讀結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，陰性和陽(yáng)性對(duì)照均由試劑廠家提供。HPV 基因分型檢測(cè)試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司）能同時(shí)檢測(cè)23 種基因型，包括低危亞型（HPV6、11、42、43、81 和83）和高危亞 型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73 和82）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV 基因型檢測(cè)

本研究入選HPV 陽(yáng)性患者共521 例，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示來(lái)自濟(jì)南地區(qū)的患者比例最高，占比41.46%（216/521）。所有檢測(cè)的23 種基因型中，檢測(cè)出23 種，不同病毒亞型總計(jì)出現(xiàn)1 055 次陽(yáng)性（含多種感染），其中低危型中HPV6 和HPV11 占比最高，分別為20.47%（216/1 055）和17.44%（184/1 055）。6 種低危型合計(jì)出現(xiàn)544 次，占比51.56%（544/1 055）；17種高危型合計(jì)出現(xiàn)511 次，占比48.44%（511/1 055），其中HPV52 和HPV16 在高危型感染中占比最高，分別為6.35%（67/1 055）和6.35%（67/1 055），見(jiàn)表1、表2。

表1 尖銳濕疣患者標(biāo)本來(lái)源例數(shù)及比例

表2 521例男性尖銳濕疣患者皮損組織HPV基因分型分布情況

2.2 HPV 感染分布情況

521 例陽(yáng)性樣本中單一型感染244 例，單一感染率為46.83%（244/521）；多種感染277 例，多種感染率為53.16%（277/521）。HPV 多種感染百分率分布曲線呈現(xiàn)指數(shù)分布趨勢(shì)，見(jiàn)表3，圖1。

表3 HPV多種感染分布

圖1 HPV多種感染百分率分布曲線圖

2.3 HPV 不同感染類型構(gòu)成情況

結(jié)果顯示，檢出單一型HPV 感染244 例，占比46.83%（244/521），在發(fā)生多種感染患者中，以高、低危 HPV 混合感染比率最高，占比42.03%（219/521），見(jiàn)表4。

表4 HPV不同感染類型構(gòu)成比

2.4 尖銳濕疣患者HPV 感染年齡分布特征

HPV 陽(yáng)性患者中年齡17 ～75 歲， 21 ～30 歲年齡段占比最高38.96%（203/521）；61 ～70 歲患者8 例，占比1.54%（8/521），70 歲以上患者占比最低0.38%（2/521），見(jiàn)表5。

表5 不同年齡段患者HPV感染構(gòu)成比

3 討論

HPV 感染與女性宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的研究是多年來(lái)的研究熱點(diǎn)，而對(duì)于男性尖銳濕疣患者HPV 感染的研究相對(duì)較少，缺乏相關(guān)的流行病學(xué)資料。近年來(lái)，尖銳濕疣由于亞臨床感染的增加和頻繁的復(fù)發(fā)率而引起了廣泛的關(guān)注。男性HPV 感染率逐年增加，除引起尖銳濕疣外，還是導(dǎo)致外生殖器癌的重要因素。一些研究顯示，HPV 亞臨床感染在不同人群和地域的分布非常復(fù)雜[7]。為探討魯中地區(qū)男性HPV感染的分布情況，筆者采用PCR-RDB，對(duì)男性尖銳濕疣患者皮損組織進(jìn)行了HPV 亞型檢測(cè)和分析。

本研究發(fā)現(xiàn)魯中地區(qū)男性尖銳濕疣患者HPV 感染亞型存在地域差異性。筆者研究的521 例HPV 陽(yáng)性患者中共檢測(cè)出23 種HPV 亞型感染，其中最常見(jiàn)的HPV 亞型依次為6、11、52、16、43。Chan 等[8]在中國(guó)香港的研究結(jié)果顯示，最常見(jiàn)的HPV 亞型依次為6、11、16、52 和84；趙平安等[9]發(fā)現(xiàn)寧夏地區(qū)尖銳濕疣患者中最常見(jiàn)的HPV 亞型分別是HPV6、11、l6 、42、18，這提示HPV 感染亞型感染是存在地域差異性的，但一個(gè)共性是HPV6/11 是感染的優(yōu)勢(shì)亞型,這對(duì)本地區(qū)男性HPV 感染的防治提供了數(shù)據(jù)支持。

HPV6/11 是魯中地區(qū)男性尖銳濕疣患者HPV感染的優(yōu)勢(shì)亞型。本研究納入的521 例HPV 陽(yáng)性感染者中，單一型HPV 感染244 例，占比46.83%（244/521），其中低危亞型以HPV6（20.47%）和HPV11（17.44%）最常見(jiàn)，而且比例明顯高于其他亞型；高危亞型以HPV52 和HPV16 最常見(jiàn)（6.35%,67/521）。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)75.62%（394/521）的患者至少有HPV6/11 其中一項(xiàng)感染，這也為未來(lái)針對(duì)男性接種HPV 疫苗提供了數(shù)據(jù)支持，僅HPV6/11 疫苗就有可能使男性尖銳濕疣的發(fā)病率下降75%以上。

HPV 多種亞型感染即多種感染所占比例最高。本研究的數(shù)據(jù)顯示，兩種及以上混合感染占53.16%，最多可達(dá)到8 種類型同時(shí)感染。其中2 種（28.41%）和3 種（13.24%）比例最高。統(tǒng)計(jì)顯示1 ～8 種HPV 亞型感染的檢出率成指數(shù)曲線趨勢(shì)，y= 1.213e-0.75x，R2 = 0.973，這提示男性HPV 感染是機(jī)會(huì)性感染，種數(shù)越多感染機(jī)會(huì)越低，這個(gè)結(jié)果的發(fā)現(xiàn)是非常有研究?jī)r(jià)值的。

HPV 不同感染類型構(gòu)成比結(jié)果顯示混合型感染即高危組和低危組兼有的感染構(gòu)成比例最高（219/521，42.03%）。多種低危型（6.53%，34/521）和多種高危型（4.61%，24/521）感染比例較低。結(jié)果表明魯中地區(qū)男性尖銳濕疣患者HPV 感染多為高、低危亞型混合感染，這提示在檢測(cè)男性尖銳濕疣患者HPV 感染時(shí)應(yīng)當(dāng)同時(shí)檢測(cè)高危組和低危組亞型，尤其是HPV6、11、52 和16，單獨(dú)低危組或高危組亞型的檢測(cè)易導(dǎo)致漏診。

通過(guò)對(duì)患者年齡分布特征的分析發(fā)現(xiàn)，21 ～30歲年齡組男性患者的HPV 感染率最高?？赡艿脑蚴谴四挲g段男性為性活躍人群，接觸性伴多，有過(guò)非婚性接觸史等導(dǎo)致這些人群感染率偏高。Schiffman等[10]認(rèn)為大多數(shù)情況下生殖器部位感染 HPV 病毒是具有自限性的，機(jī)體能自行清除病毒而不會(huì)發(fā)生相關(guān)病變。HPV 的潛伏感染或亞臨床感染，或是患者免疫功能低下無(wú)法自行清除病毒而導(dǎo)致的持續(xù)性感染則會(huì)引起生殖器疣或是生殖器癌癥等疾病。因此對(duì)尖銳濕疣患者HPV 分型的檢測(cè)及早期干預(yù)對(duì)患者的預(yù)后意義重大。綜上所述，魯中地區(qū)男性尖銳濕疣患者HPV 感染主要以HPV6、11 、16 和52 型為主，多發(fā)于21 ～30 歲男性，多種HPV 混合感染較單一型感染比例高，其中以高、低危型混合感染常見(jiàn)。

本研究結(jié)果有助于掌握魯中地區(qū)男性HPV 感染的分子流行病學(xué)特征，為未來(lái)防治男性HPV 感染提供依據(jù)。