魚(yú)腥草總黃酮化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)的影響分析

徐靜 朱國(guó)慶 周義浪 王敏 孫麗娥 蔣梅

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 貴州 貴陽(yáng) 550003）

魚(yú)腥草是一類在東南亞地區(qū)或國(guó)內(nèi)南方地區(qū)大規(guī)模生長(zhǎng)的三白草科蕺菜，其主要功效為：清熱解毒、利尿通淋等。有研究者對(duì)魚(yú)腥草的藥理作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)腥草除上述作用外，還有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒等功效[1]。黃酮類化合物是一類多酚化合物，在多類植物中都廣泛存在，能夠阻礙細(xì)胞的增殖，對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo)，同時(shí)還可對(duì)抑癌基因的活性產(chǎn)生加強(qiáng)作用，并對(duì)癌基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用[2]。本研究在研究開(kāi)始前，對(duì)魚(yú)腥草總黃酮化合物的成分和含量進(jìn)行檢測(cè)和分析，并在此基礎(chǔ)上圍繞其對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)的阻抑作用進(jìn)行研究，期望對(duì)魚(yú)腥草的抗癌作用機(jī)理進(jìn)行詳細(xì)闡述，為魚(yú)腥草在臨床抗腫瘤的實(shí)際運(yùn)用中提供參考。

1.資料與方法

1.1 藥材

本研究于2016年8月在貴陽(yáng)市百宜鄉(xiāng)和遵義市的新浦區(qū)魚(yú)腥草種植基地內(nèi)選取本研究所用的新鮮魚(yú)腥草的根和葉。送至貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院進(jìn)行鑒定，確定本研究所采取的魚(yú)腥草是三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草。

1.2 試劑與細(xì)胞株

本研究使用的試劑有：二甲基亞砜（DMSO）（由江西洪瑞生物技術(shù)有限公司提供）、四甲基偶氮唑藍(lán)干粉（同上）、碘化丙啶（同上）。AnnexinV-FITC/FITC雙染試劑盒（同上）。蘆丁是本研究自行配制的，其濃度＞98%。AB-8型大孔吸附樹(shù)脂由天津南開(kāi)大學(xué)化工廠提供。

人肝癌細(xì)胞BEL-7402由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.3 黃酮提取物樣品溶液的配制

對(duì)粗提取物進(jìn)行稱量，將適量的黃酮提取物放入無(wú)血清培養(yǎng)基中溶解，配制濃度為6.4g/L的母液，使用規(guī)格為0.22μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，然后將其封存放置于溫度為4℃的環(huán)境中留存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞BEL-7402放置在無(wú)菌DMEM細(xì)胞發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)擰培養(yǎng)，并將其放置在環(huán)境溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3天左右的時(shí)間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一次傳代，選取生長(zhǎng)期為對(duì)數(shù)的細(xì)胞作為本研究的樣本細(xì)胞。

1.5 魚(yú)腥草總黃酮提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402體外增殖的作用研究

運(yùn)用DMEM培養(yǎng)液，對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402進(jìn)行稀釋，配制成0.5×108L-1的細(xì)胞懸液，并在96孔板上進(jìn)行接種，各孔均有100μL的培養(yǎng)液和5000個(gè)細(xì)胞，將其放置在環(huán)境溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后，將濃度為0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L的魚(yú)腥草總黃酮化合物分別加入到培養(yǎng)板中，各個(gè)濃度水平的藥物均設(shè)置了3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置不添加任何藥物的細(xì)胞以及添加溶劑的細(xì)胞作為對(duì)照組，同時(shí)還設(shè)置調(diào)零孔，將其放置在環(huán)境溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間為48小時(shí)。

1.6 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

運(yùn)用AnnexinV/P I雙染-流式檢測(cè)方法，對(duì)細(xì)胞凋亡的水平進(jìn)行檢測(cè)。在6孔板中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于此，人肝癌細(xì)胞BEL-7402的濃度水平是2.5×108L-1，各孔的接種量為2ml，將其放置在環(huán)境溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞完全貼壁以后，吸取培養(yǎng)液后放棄，將藥物濃度為0.5g/L、0.8g/L、2.0g/L的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液分別加入其中，并設(shè)置對(duì)照孔，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間為48小時(shí)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 魚(yú)腥草總黃酮提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402體外增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，魚(yú)腥草總黃酮化合物的濃度為0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L時(shí)，會(huì)以濃度依賴性的形式，對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402的增殖產(chǎn)生阻抑作用，且魚(yú)腥草總黃酮化合物的濃度越大，抑制水平越高。

2.2 魚(yú)腥草總黃酮提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402凋亡產(chǎn)生的影響

AnnexinV/P I雙染-流式檢測(cè)結(jié)果顯示，魚(yú)腥草總黃酮化合物發(fā)揮藥效后，當(dāng)濃度為0.5g/L、0.8g/L，且作用48小時(shí)后，細(xì)胞凋亡的數(shù)量在一定程度上升，當(dāng)濃度達(dá)到2.0g/L時(shí)，細(xì)胞凋亡水平達(dá)到最大值，總細(xì)胞凋亡水平為89.7%。其中在添加藥物的組中，早期凋亡的細(xì)胞水平在一定程度上有所增加。

3.討論

臨床醫(yī)學(xué)認(rèn)為，魚(yú)腥草能夠清肺化痰，同時(shí)還能夠治療白血病、抵抗癌細(xì)胞和氧化放映。本研究開(kāi)展前，曾通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在魚(yú)腥草中，含有黃酮、生物堿等成分，且發(fā)現(xiàn)部分以魚(yú)腥草為主要藥材的藥品，如先魚(yú)湯、參慈膠囊等，可對(duì)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生阻抑作用，效果十分理想。黃酮類化合物是一類多酚化合物，在多類植物中均可檢測(cè)出該物質(zhì)，其潛在的藥用價(jià)值較高，目前臨床研究者熱衷于對(duì)其抗腫瘤的作用進(jìn)行研究。本研究運(yùn)用魚(yú)腥草總黃酮化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)的抑制作用進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，在人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)過(guò)程中，魚(yú)腥草總黃酮提取物可發(fā)揮顯著的阻抑作用，依據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置不同濃度水平的藥物組，運(yùn)用流式細(xì)胞儀，對(duì)魚(yú)腥草總黃酮化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)的影響進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，在人肝癌細(xì)胞BEL-7402的生長(zhǎng)過(guò)程中，魚(yú)腥草總黃酮化合物能夠阻抑作用。

綜上所述，在人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)中，魚(yú)腥草總黃酮提取物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。