基于果蠅模式生物差異基因表達(dá)的刺玫果抗衰老作用機(jī)理研究

翟春梅，懷 雪，孟祥瑛，付敬菊，秦 蓁，孟永海

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040

刺玫果(RosadavuricaPall.)野生資源豐富，主要分布于我國(guó)東北、華北地區(qū)，且營(yíng)養(yǎng)豐富，民間大量采食或用于泡茶、泡酒等。刺玫果具有提高免疫力、改善人體疲勞等保健功能，是一種多營(yíng)養(yǎng)、多功能、多用途的藥食同源寶貴資源[1-4]，黑龍江省具有得天獨(dú)厚的資源優(yōu)勢(shì)。課題組前期研究表明：刺玫果醇提物可顯著果蠅延長(zhǎng)壽命。本研究進(jìn)一步采用RNA-Seq技術(shù)從基因整體表達(dá)水平探求刺玫果醇提物是如何在果蠅體內(nèi)引起一系列生物學(xué)變化從而達(dá)到延長(zhǎng)果蠅壽命的作用機(jī)理，并從整體水平分析給予刺玫果醇提物后果蠅基因及蛋白表達(dá)與功能的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

Gene Expression Wash Pack(Agilent);RNeasy Mini Kit(Qiagen);RNA提取試劑盒(賽默飛Applied Biosystem);渦旋儀(上海達(dá)姆，型號(hào)：VORTEX4);磁力攪拌器(塞力斯，型號(hào)：TALBOYS);恒溫金屬浴(威泰克，型號(hào)：Block Heater HB-2);離心濃縮儀(德國(guó)Eppendorf，型號(hào)：5301);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏，型號(hào)：DNP-9022);-80 ℃冰箱(美國(guó)Thermo，型號(hào)：902-ULTS);冷藏冰箱(美國(guó)Thermo，型號(hào)：THM#REL5004V);超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司Milli-Q plus)。刺玫果原料采于黑龍江省加格達(dá)奇大興安嶺地區(qū)，刺玫果醇提物實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法見(jiàn)前期研究基礎(chǔ)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

將羽化12 h內(nèi)的新生果蠅雌雄分開(kāi)，雌性果蠅隨機(jī)保留30只，空白組與給藥組各15只，空白組用普通培養(yǎng)基飼養(yǎng)，給藥組在培養(yǎng)基中添加0.46%的刺玫果醇提物喂養(yǎng)，第三十天時(shí)，將雌果蠅饑餓2 h后移入液氮中2 h，放置-80 ℃冰箱保存，每組做三個(gè)樣品為平行試驗(yàn)。

1.2.2 文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)與測(cè)序

為了保證數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，應(yīng)當(dāng)確保文庫(kù)的質(zhì)量，經(jīng)過(guò)檢測(cè)的樣本經(jīng)Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，當(dāng)文庫(kù)的有效濃度可大于2 nM時(shí)，完成文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)要求，才可通過(guò)IlluminaHiSeq軟件進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.2.3 原始數(shù)據(jù)的處理方法

1.2.3.1 原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求

在數(shù)據(jù)分析之前，要保證Reads的質(zhì)量足夠高，這樣才能使后續(xù)分析結(jié)果更精準(zhǔn)。首先將含有接頭的Reads去除干凈，其次去除質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條Read的50%以上的Reads和N的比例大于10%的低質(zhì)量的Reads。經(jīng)上述過(guò)程，得到高質(zhì)量的Clean Data。

1.2.3.2 將參考基因組序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)比

通過(guò)TopHat2軟件將參考基因組與Clean Reads進(jìn)行序列對(duì)比，以獲取在基因上或者參考基因組的位置信息，再對(duì)比測(cè)序樣品中序列特有信息，使Reads盡可能全面的比對(duì)到參考基因上，這樣可使數(shù)據(jù)的利用率大大提高。

1.2.4 SNP/InDel位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)及預(yù)測(cè)

變異位點(diǎn)主要在基因組的基因間區(qū)、基因區(qū)和CDS區(qū)，可通過(guò)變異位點(diǎn)在參考基因組上的位置或者參考基因組上的基因位置信息來(lái)確定變異位點(diǎn)以及變異產(chǎn)生的同義或非同義影響。使用TopHat2軟件統(tǒng)計(jì)與預(yù)測(cè)SNP位點(diǎn)，SAM- tools軟件查找SNP在基因區(qū)的潛在位點(diǎn)。結(jié)果對(duì)比分析，樣品的可變剪切類型和表達(dá)量通過(guò)ASprofile[6]軟件獲得。

1.2.5 基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化分析與新基因注釋

兩個(gè)生物學(xué)條件之間的差異表達(dá)基因集是通過(guò)DEseq分析樣本組間的差異表達(dá)得到的。其差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)滿足fold change≥2且FDR<0.05。使用Cufflinks軟件對(duì)新基因進(jìn)行注釋發(fā)掘。將發(fā)掘的新基因與Swiss-Prot、NR、COG、GO、KEGG、Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)基因序列，用HMMER 軟件對(duì)比預(yù)測(cè)的氨基酸序列，得到新基因的注釋信息。

1.2.6 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析(Gene Ontology，GO)

將刺玫果給藥組與空白組果蠅差異基因?qū)隓AVID在線分析平臺(tái)進(jìn)行基因功能注釋和富集分析。應(yīng)用基因注釋功能數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒別差異表達(dá)基因發(fā)生的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)差異基因分別從細(xì)胞成分(CC)、分子功能(MF)、生物學(xué)過(guò)程(BP)三方面進(jìn)行基因注釋和GO功能聚類分析，采用Fisher檢驗(yàn)的計(jì)算方法，計(jì)算每個(gè)GO顯著性水平，并找出篩選的差異基因顯著性GO與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。

1.2.7 基于KEGG的信號(hào)通路富集分析(Pathway Analysis)

KEGG是一個(gè)整合了系統(tǒng)功能信息、基因組和生物化學(xué)的數(shù)據(jù)庫(kù)。它具有強(qiáng)大的功能，可把檢測(cè)到的差異基因與更高級(jí)別的生物系統(tǒng)的功能水平關(guān)聯(lián)起來(lái)。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，并對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway注釋，得到其全部參與的Pathway，在鑒別差異基因參與的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)解釋說(shuō)明差異基因?qū)C(jī)體的影響。采用Fisher檢驗(yàn)的計(jì)算方法，計(jì)算每個(gè)Pathway顯著性水平，并找出篩選的差異基因顯著性與哪些富集的Pathway顯著相關(guān)。對(duì)差異表達(dá)基因KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分析，對(duì)代謝相關(guān)上調(diào)基因進(jìn)行KEGG通路注釋并篩選其所涉及的代謝過(guò)程及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用TopHat2、Cufflinks、ASprofile等軟件對(duì)RNA-Seq的剪切[5]，BLAST軟件是基本局部匹配查詢工具，用來(lái)快速比較序列的生物學(xué)信息，DESeq對(duì)RNA差異表達(dá)進(jìn)行分析、EBSeq對(duì)基于貝葉斯方法的RNA差異表達(dá)分析，topGO軟件對(duì)基因進(jìn)行基因本體富集分析，采用NR、Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)非冗余蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，采用GO、COG、KOG、Pfam等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因本體、同源蛋白質(zhì)簇、蛋白質(zhì)同源性聚類分析，采用KEGG、STRING、Ensembl對(duì)差異基因的功能及相互作用進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

空白和給藥樣品的Clean Reads中分別有24 872 937和24 875 689個(gè)，各樣本Q30均大于95.51%，GC大于54.17%。在測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)中顯示各樣品Q30堿基百分比均大于95.15%，符合樣本要求。

2.2 SNP/InDel位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)及預(yù)測(cè)

表1統(tǒng)計(jì)各類型SNP位點(diǎn)所占的比例，SNP注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖與InDel的注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖1與圖2。

表1 各類型SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of various types of SNPs

圖1 SNP注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Fig.1 Statistical chart of SNP annotation results

本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)6個(gè)果蠅樣品轉(zhuǎn)錄測(cè)序分析共得到可靠的SNP位點(diǎn)總數(shù)798 931個(gè)，其中776 338個(gè)SNP位點(diǎn)位于基因區(qū)。占總數(shù)的97.17%。6個(gè)樣品中顛換型的SNP位點(diǎn)數(shù)約占總SNP位點(diǎn)數(shù)的37%，轉(zhuǎn)換型的SNP位點(diǎn)數(shù)量約占62%，SNP位點(diǎn)中雜合型SNP占60%以上。

2.3 基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化分析與新基因注釋結(jié)果

使用Cufflinks軟件共注釋發(fā)掘614個(gè)新基因。將發(fā)掘的新基因與Swiss-Prot、NR、COG、GO、KEGG、Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)基因序列，用HMMER 軟件對(duì)比預(yù)測(cè)的氨基酸序列，得到新基因的注釋信息。統(tǒng)計(jì)如表2。

圖2 InDel的注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Fig.2 InDel annotated result statistical map

表2 果蠅的新基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of annotated results ofnew gene functions in Drosophila

2.4 差異基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果

經(jīng)DEseq及Gene Ontology分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺玫果給藥組與空白組相比差異基因?yàn)?28個(gè)，顯著下調(diào)的基因有75個(gè)，其基因分別為：CG8736(FBgn0033308)、CG5172(FBgn0030830)、RH61745(FBgn0030829)、Acp1(FBgn0014454)、Cpr97 Ea(FBgn0039480)、Fbp2(FBgn0000640)、stnA(FBgn0016976)、Fbp1 P1(FBgn0000639)、Cpr92F(FBgn0038819)等。顯著上調(diào)基因有53個(gè)，其中新基因有4個(gè)，其余基因有Hsp(FBgn0001230)、PH4alphaNE3(FBgn0051017)、CG32199(FBgn0052199)、anon-EST(FBgn0035257)、CG12783(FBgn0038448)、CG14240(FBgn0039435)、gsb-RA(FBgn0001148)、Sfp70A4(FBgn0259970)、Acp54A1(FBgn0083936)、CG6628(FBgn0036072)、Acp BEST(FBgn0043825)等。

2.5 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析結(jié)果

差異基因的GO富集分析見(jiàn)圖3。差異基因的GO富集共有60條注釋信息。差異表達(dá)基因GO注釋分類結(jié)果表明：在生物學(xué)過(guò)程中，細(xì)胞過(guò)程、生物學(xué)過(guò)程、生物學(xué)規(guī)律、進(jìn)化過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞成分組織或生物合成、生物粘附、節(jié)律過(guò)程有明顯差異；在細(xì)胞組分中，細(xì)胞代謝、組織、膜高分子組成、細(xì)胞間隙、膜封閉有明顯差異；在分子功能中，結(jié)合活性、催化活性、受體活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、結(jié)構(gòu)分子活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性有明顯差別。

2.6 差異基因KEGG注釋和富集通路分析結(jié)果

結(jié)果表明，由29個(gè)基因注冊(cè)到19條通路包括花生四烯酸代謝(ko00590)、光傳導(dǎo)-飛行通路(ko04745)、磷酸鹽與磷酸酯代謝(ko00440)、精氨酸與脯氨酸代謝(ko00330)、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)途徑-多物種(ko04213)、甘油磷脂代謝(ko00564)、剪接體(ko03040)、蛋白表達(dá)通路(ko03060)、醚脂代謝(ko00565)、內(nèi)吞作用(ko04144)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(ko04141)、氨基糖與核苷酸糖代謝(ko00520)、谷胱甘肽代謝(ko00480)、藥物代謝-細(xì)胞色素P450(ko00982)、細(xì)胞色素P450(ko00980)、氧化磷酸化代謝通路(ko00190)等(見(jiàn)表3)。

圖3 差異基因的GO富集分析Fig.3 Gene Ontology enrichment analysis of differentially expressed genes

表3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

2.7 刺玫果對(duì)果蠅差異基因及通路網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)意義分析

根據(jù)“2.6”項(xiàng)下結(jié)果，選取了幾條對(duì)于機(jī)體抗氧化、新陳代謝、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)方面的通路進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，如圖1所示。

圖1 刺玫果影響果蠅主要通路及生物學(xué)意義總結(jié)圖Fig.1 Summary of main pathways and biological significance of Drosophila affected by Rosa davurica Pall.

2.7.1 刺玫果對(duì)氧化磷酸化信號(hào)通路的影響

氧化磷酸化在機(jī)體各組織能量代謝中的地位十分重要。氧化磷酸化是生物化學(xué)過(guò)程[7]，發(fā)生在原核生物的細(xì)胞質(zhì)中，或發(fā)生在真核細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜上的偶聯(lián)反應(yīng)[8]，其作用是氧化糖、氨基酸、脂等有機(jī)物在分解釋放能量，供給ADP與無(wú)機(jī)磷酸合成ATP的過(guò)程。磷酸化(phosphorylation)是指在生物氧化中生成ATP的作用。機(jī)體生成ATP有兩種方式，一種是氧化磷酸化，通過(guò)呼吸鏈電子傳遞，偶聯(lián)生成ATP。生物體ATP絕大多數(shù)來(lái)源這種形式。另一種是底物水平磷酸化，代謝物脫氫后，使分子內(nèi)能量重新分布，無(wú)機(jī)磷酸酯化形成中間代謝，使ADP變成ATP的過(guò)程。刺玫果可影響ATPe基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)ADP的電子傳遞、H+傳遞及氧的利用，從而產(chǎn)生產(chǎn)生H2O和ATP，全身功能。通過(guò)測(cè)序結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，給與刺玫果喂養(yǎng)的果蠅體內(nèi)ATPe(F型H+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶C亞單位)基因表達(dá)增高，上調(diào)氧化磷酸化代謝通路，從而影響果蠅的能量代謝。

2.7.2 刺玫果對(duì)谷胱甘肽代謝通路的影響

谷胱甘肽不僅能消除人體自由基[9]，還可以提高人體免疫力,維護(hù)健康，抗衰老，在老人遲緩化的細(xì)胞上所發(fā)揮的功效比年輕人大。谷胱甘肽不僅可使血紅蛋白不受自由基氧化從而維持氧氣的運(yùn)輸，而且還可以保護(hù)紅細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的巰基處于還原狀態(tài)，有效的防止溶血。給與刺玫果喂養(yǎng)的果蠅，體內(nèi)谷胱甘肽含量明顯增加，提示其抗自由基活性增強(qiáng)，從而具有延緩衰老的作用。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，刺玫果影響果蠅體內(nèi)GstS1(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)基因，上調(diào)谷胱甘肽的代謝通路，使果蠅體內(nèi)谷胱甘肽含量明顯增加從而增強(qiáng)果蠅抗氧化能力延緩衰老。

2.7.3 刺玫果對(duì)長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)途徑的影響

HSP是一種被熱激或其他脅迫條件所誘導(dǎo)的分子伴侶，具有參與細(xì)胞運(yùn)輸、蛋白降解，亞基組成和蛋白折疊的功能調(diào)節(jié)蛋白的功能和活性[10]。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，HSP可加速異常蛋白質(zhì)的降解，抵抗細(xì)胞損傷以維持細(xì)胞的正常代謝。同時(shí)，HSP還可以與蛋白酶等構(gòu)成細(xì)胞抗氧化防御體系，防止氧化自由基所致的蛋白損傷，起到抗衰老的作用[11]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，給與刺玫果醇提物喂養(yǎng)的果蠅壽命得到了顯著的延長(zhǎng)，RNA-Seq結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，給藥組果蠅體內(nèi)HSP基因表達(dá)顯著提高，對(duì)長(zhǎng)壽代謝途徑有明顯的上調(diào)作用，這無(wú)疑提高了果蠅應(yīng)激能力和果蠅體內(nèi)蛋白質(zhì)空間構(gòu)像，使果蠅體內(nèi)蛋白質(zhì)聚集折疊幾率降低，促進(jìn)跨膜運(yùn)輸，增加果蠅免疫能力和耐熱性，保護(hù)細(xì)胞活動(dòng)和細(xì)胞生存等方面延長(zhǎng)果蠅壽命。

2.7.4 刺玫果對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工代謝通路的影響

研究表明，當(dāng)果蠅給予一定劑量的刺玫果醇提物喂養(yǎng)后，與空白對(duì)照組相比老年果蠅體內(nèi)HSP90和HSC71基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，以加速降解受損蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞的正常功能。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶3(PDIA3)具有催化蛋白質(zhì)二硫鍵形成、氧化還原及異構(gòu)化的作用，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中PDI家族的一員。Chichiarelli等[12]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PDIA3可通過(guò)結(jié)合特殊的DNA修復(fù)蛋白來(lái)參與應(yīng)激反應(yīng)，CCT3屬于TCP1的Y亞單位，是HSP60家族蛋白的分子伴侶復(fù)合體，與ATP依賴的方式和細(xì)胞骨架蛋白組裝，對(duì)肌動(dòng)蛋白等重要的蛋白質(zhì)的折疊起著重要的作用。衰老會(huì)加速蛋白錯(cuò)誤折疊及變性，對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生不可逆的不利影響，刺玫果醇提物可通過(guò)上調(diào)HSP家族基因的表達(dá)，上調(diào)蛋白質(zhì)加工通路來(lái)修復(fù)衰老引起的蛋白質(zhì)受損。

2.7.5 刺玫果對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)表達(dá)代謝通路的影響

IMP2基因在腦、骨髓、腸、肌肉、胰腺、腎臟、腫瘤等人組織中廣泛表達(dá)，IMP2基因不僅與糖尿病和調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的粘附和活動(dòng)相關(guān)，還在成肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞增殖過(guò)程中顯示重要的作用，這個(gè)作用受到HMGA2基因的調(diào)節(jié)[13-15]。刺玫果可增加IMP2基因在果蠅體內(nèi)表達(dá)含量，從而提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)表達(dá)的代謝通路，提高蛋白質(zhì)正確的折疊、蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運(yùn)、糖基化修飾和質(zhì)控等。

2.7.6 刺玫果對(duì)剪切體代謝通路的影響

剪切體是在剪接過(guò)程的各個(gè)階段隨著snRNA的加入而形成的。也就是說(shuō)在完整的pre-mRNA 上形成的一個(gè)剪接中間體[16]。剪接體本身需要一些不會(huì)翻譯出任何蛋白的小核RNA的參與，這些小核RNA對(duì)調(diào)控遺傳活動(dòng)起著重要的作用。刺玫果醇提物通過(guò)上調(diào)剪切體代謝通路調(diào)控RNA的合成和有關(guān)蛋白質(zhì)合成，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的各項(xiàng)生理功能。

2.7.7 刺玫果對(duì)磷酸鹽代謝通路的影響

無(wú)機(jī)磷酸鹽[17]可作為有氧代謝和糖酵解的激活劑。近年來(lái)運(yùn)動(dòng)時(shí)高能磷酸鹽的代謝與運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生有了較深刻的認(rèn)識(shí)，磷酸鹽代謝與肌肉收縮力和運(yùn)動(dòng)能力有密切關(guān)系。當(dāng)人體進(jìn)行大量的運(yùn)動(dòng)過(guò)后，體內(nèi)肌細(xì)胞中的磷濃度比正常狀態(tài)下高3倍以上，最高則高達(dá)10倍。這促使Ca2+進(jìn)入線粒體內(nèi)，不但影響肌細(xì)胞中各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)Ca2+的敏感性，而且還影響氧化磷酸鹽產(chǎn)生ATP的效果，使肌肉能力降低。果蠅攀爬強(qiáng)度的爬運(yùn)動(dòng)可影響PCYT1(膽堿磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶)基因的表達(dá)含量，從而影響無(wú)機(jī)鹽的代謝通過(guò)，可能通過(guò)ATP和對(duì)Ca2+的敏感性改變果蠅抗疲勞作用，從而對(duì)果蠅攀爬能力產(chǎn)生影響。

2.7.8 刺玫果對(duì)精氨酸和脯氨酸代謝通路的影響

精氨酸在動(dòng)物體內(nèi)可以通過(guò)精氨酸酶分解成鳥甘酸和尿素。而合成胺類的前體就是鳥苷酸，它們促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，在細(xì)胞體內(nèi)起著重要的作用。精氨酸[18]在相關(guān)酶作用可轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺、脯氨酸、腐胺，腐胺可以生成精胺和亞精胺，統(tǒng)稱為多胺。谷氨酰胺可在三羧酸循環(huán)過(guò)程中氧化供能產(chǎn)生CO2。精氨酸還可經(jīng)一氧化氮合成酶的氧化途徑，生成具有一定生物活性的一氧化氮，精氨酸還通過(guò)氧化途徑,經(jīng)一氧化氮合成酶(NOS) 催化生成具有維持血管張力的恒定與調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)定等重要生物活性的一氧化氮(NO)。NO作為內(nèi)皮舒張因子可維持血管的通透性,改善腸道的缺氧和缺血功能。NO也能在神經(jīng)細(xì)胞系統(tǒng)間發(fā)揮作用，促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶功能。研究表明，刺玫果醇提物給藥后，上調(diào)了P4HA(脯氨酰4-羥化酶)基因精氨酸和脯氨酸代謝通路，增加果蠅氧化功能作用，延緩果蠅衰老。

3 討論

給與刺玫果醇提物喂養(yǎng)的果蠅與空白對(duì)照組果蠅相比，共發(fā)現(xiàn)128個(gè)差異基因，其中包括53個(gè)上調(diào)，75個(gè)下調(diào)。其中103個(gè)差異基因的來(lái)源基因可注釋到包括細(xì)胞進(jìn)程、分子功能進(jìn)程及生物進(jìn)程在內(nèi)的60個(gè)GO條目，上述來(lái)源基因還可注釋到19條KEGG代謝通路，由29個(gè)基因注冊(cè)到19條通路包括花生四烯酸代謝(ko00590)、光傳導(dǎo)-飛行通路(ko04745)、磷酸鹽與磷酸酯代謝(ko00440)、精氨酸與脯氨酸代謝(ko00330)、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)途徑-多物種(ko04213)、甘油磷脂代謝(ko00564)、海馬信號(hào)通路(ko04391)、吞噬體(ko04145)、α-亞麻酸代謝(ko00592)、剪接體(ko03040)、蛋白表達(dá)通路(ko03060)、醚脂代謝(ko00565)、內(nèi)吞作用(ko04144)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(ko04141)、氨基糖與核苷酸糖代謝(ko00520)、谷胱甘肽代謝(ko00480)、藥物代謝-細(xì)胞色素P450(ko00982)、細(xì)胞色素P450(ko00980)、氧化磷酸化代謝通路(ko00190)等。在果蠅行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，果蠅抗氧化能力增加且體內(nèi)抗氧化指標(biāo)谷胱甘肽、SOD等氧化指標(biāo)發(fā)生變化。通過(guò)果蠅RNA-Seq測(cè)序結(jié)果表明，刺玫果醇提物可調(diào)控ATPe、P450、HPGDS、P4HA基因影響果蠅抗氧化能力。推測(cè)果蠅抗氧化應(yīng)激能力提高，體內(nèi)抗氧化指標(biāo)谷胱甘肽等指標(biāo)發(fā)生改變與這些基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

在果蠅行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中其攀爬能力、果蠅體內(nèi)肝、肌糖原、LDA等能量代謝指標(biāo)發(fā)生變化，基因測(cè)序結(jié)果表明刺玫果醇提物可影響ATPe、CHS1、PLA2G、PCYT1、P4HA、PTGS、HPGDS基因的表達(dá)調(diào)節(jié)果蠅體內(nèi)氨基酸糖、花生四烯酸、脂類和磷酸鹽等能量代謝通路，推測(cè)果蠅體內(nèi)肝、肌糖原、LDA等能量代謝指標(biāo)發(fā)生變化與這些基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，刺玫果醇提物使果蠅壽命延長(zhǎng)還體現(xiàn)在可上調(diào)HSP、HSP70、HSP73等長(zhǎng)壽基因和IMP2基因來(lái)提高了果蠅應(yīng)激能力，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)加工通路來(lái)修復(fù)衰老引起的蛋白質(zhì)受損，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能維持細(xì)胞的生存能力，降低蛋白在表達(dá)過(guò)程中的出現(xiàn)異樣的伸展、折疊和解聚等情況來(lái)延緩果蠅壽命。除此之外，刺玫果醇提物提取物還可下調(diào)ACTB-G1、Actin、HIPPO等基因調(diào)控果蠅吞噬體內(nèi)吞作用、光傳導(dǎo)和HIPPO等信號(hào)通路，這些通路是如何作用在果蠅體內(nèi)和果蠅的表現(xiàn)形式等一系列問(wèn)題，有待更深入的研究。通過(guò)對(duì)正常喂養(yǎng)和刺玫果醇提物喂養(yǎng)的30日齡果蠅的基因序列進(jìn)行深入分析，提供了基因在正常喂養(yǎng)和刺玫果喂養(yǎng)的果蠅生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)譜和差異表達(dá)信息。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明刺玫果抗衰老作用機(jī)制和綜合開(kāi)發(fā)利用野生刺玫果提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。