太子參內(nèi)生真菌NSZJ-1抗氧化活性的初步研究

王俊麗，王 龍，歐陽湖，焦松林，任建國

貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴陽 550025

太子參為中藥材的一種，有保護(hù)心肌功能、促進(jìn)免疫、抗應(yīng)激、治療糖尿病、止咳等功效。目前在福建、貴州、江蘇、安徽等地均有種植生產(chǎn)，但由于連作障礙、化肥和農(nóng)藥等過度施用現(xiàn)象的存在，使得藥材品質(zhì)下降，進(jìn)而影響到其藥用安全問題。鑒于植物內(nèi)生菌會產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分[1]，且其發(fā)酵不受季節(jié)環(huán)境條件的影響，因而有望代替中藥材的種植生產(chǎn)來獲得藥用活性成分。已有眾多關(guān)于藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生活性成分的研究報道，如從銀杏(Ginkgobiloba)葉中分離得到可產(chǎn)生抑菌(Rhizoctoniasolani和Sclerotiniasclerotiorum)物質(zhì)sporothriolide的內(nèi)生真菌Nodulisporiumsp.A21[2]；從青藤(Sinomeniumacutum)葉中分離得到具有細(xì)胞(Hela,HCT116和A549細(xì)胞系)毒性活性成分sinopestalotiollides A-D的內(nèi)生真菌Pestalotiopsispalmarum[3]；從藥用植物Polygalaelongata中分離得到具有抗氧化活性(ABTS和DPPH自由基)的內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.[4]，另外從藥用植物Azadirachtaindica中分離得到的5株內(nèi)生真菌次生代謝物有機提取物活性表明，其具有抑菌、抗氧化和抗糖尿病功能，因而可用于特定藥物的生產(chǎn)上[5]。Tanapichatsakul等[6]從越南肉桂(Cinnamomumloureiroi)葉中分離得到能產(chǎn)生丁香油酚的內(nèi)生真菌Neopestalotiopsissp.和Diaporthesp.，其代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出明顯的抑菌活性和抗氧化活性。關(guān)于太子參內(nèi)生真菌的研究僅有有限報道[7]，為此，本研究計劃從貴州省道地藥材太子參中去分離內(nèi)生真菌，以研究其代謝產(chǎn)物抗氧化活性，為天然活性化合物的獲得奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：新鮮太子參(Pseudostellariaheterophylla)塊根(來自貴州省施秉縣牛大場鎮(zhèn)太子參種植基地)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma公司)；福林酚試劑(上海荔達(dá)生物科技有限公司)；沒食子酸(中國藥品生物制品鑒定所)；抗壞血酸(中國藥品生物制品鑒定所)；其它化學(xué)試劑均為分析純。

儀器：Multiskan GO酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技)；FA1004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；GL-21B離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)；CLG-32L全自動高壓滅菌器(日本ALP)；SW-CJ-1B超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；ZGP-9050P隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海喆圖科學(xué)儀器有限公司)；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)用于分離、活化真菌，馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)用于菌株發(fā)酵。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化

把采集來的新鮮無病斑太子參塊根樣品用自來水清洗干凈、風(fēng)干，然后依次用75%的酒精表面消毒1 min、5%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，再用無菌水清洗5次，取100 μL的第5次清洗液放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板中，進(jìn)行涂布培養(yǎng)(30 ℃)，以確證表面徹底消毒。

在超凈工作臺上把經(jīng)表面消毒的太子參塊根切成約1 cm見方的組織塊，放入PDA平板中，每個平板等間距放置3個組織塊，于30 ℃下恒溫培養(yǎng)以分離內(nèi)生真菌。通過不定期觀察，將從塊根上已經(jīng)分離出的菌絲體移接于其它PDA平板上，恒溫培養(yǎng)(30 ℃)且觀察真菌是否純化。純化菌株移接PDA試管培養(yǎng)、低溫保存和備用。

1.2.2 內(nèi)生真菌的致病性測定

將分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行致病性測定：首先對新鮮無病斑太子參塊根進(jìn)行表面消毒(采用實驗“1.2.1”中的消毒方法)，然后用解剖刀橫切塊根約為相等兩份，分別置于用無菌水浸潤的滅菌濾紙(位于培養(yǎng)皿內(nèi))上，在其中的一份塊根組織切口處接種內(nèi)生真菌，另一份不接種作為對照，用封口膜密封培養(yǎng)皿，28 ℃下恒溫培養(yǎng)，觀察塊根切口致病情況。若組織切口有變褐、軟化，且菌絲體大量生長，初步判斷為該內(nèi)生真菌為病原真菌。該菌株再經(jīng)柯赫氏法則驗證后，即為病原真菌，否則為內(nèi)生真菌。

1.2.3 內(nèi)生真菌的鑒定

致病性內(nèi)生真菌的初步鑒定依照PDA平板培養(yǎng)特征、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子的顯微觀察進(jìn)行；而非致病性內(nèi)生真菌的鑒定步驟如下：從PDA平板上挑取少量菌絲體移入已滅菌的盛50 mL 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)三角瓶中，28 ℃、120 rpm水浴振蕩搖床培養(yǎng)7天，用滅菌玻璃棒挑取菌絲團(tuán)進(jìn)行DNA提取。具體提取過程參考真菌DNA提取試劑盒說明書(Qiagen 69104 DNeasy Plant Mini Kit(50)，德國QIAGEN公司)。采用引物ITS1和ITS4擴增內(nèi)生真菌菌株的rDNA ITS區(qū)，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性0.5 min，55 ℃復(fù)性1.0 min，72 ℃延伸0.5 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序所得的序列，利用BLAST與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對，尋找相似度最高的菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定內(nèi)生真菌的分類地位。

1.2.4 內(nèi)生真菌抗氧化活性試驗

將內(nèi)生真菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取6 mm菌碟接種于150 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中培養(yǎng)，29 ℃、180 rpm培養(yǎng)5天，以不接種內(nèi)生真菌的培養(yǎng)液作為空白對照，重復(fù)3次。依照Pan等[8]方法進(jìn)行石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物制備和6個不同濃度各提取物供試液制備(見表1)。DPPH自由基清除能力測定參考余蘭彬等方法[9]；羥自由基(·OH)清除能力測定參考任薇等方法[10]；以1 mmol/L抗壞血酸為陽性對照。

表1 不同極性供試液濃度設(shè)置Table 1 Concentration setting of the different polar solutions assayed (mg/mL)

1.2.5 內(nèi)生真菌抗氧化成分分析

多酚含量測定采用福林酚法[11]。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用蒸餾水配制濃度為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL沒食子酸溶液，分別取上述溶液1 mL于25 mL試管中，再加1.0 mL福林酚試劑、23.0 mL 5%碳酸鈉溶液，混勻后于25 ℃水浴60 min，在745 nm下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=47.786x+0.104 3(R2=0.972 7)。

樣品含量測定：取5 μL樣品溶液于EP管，加5 μL福林酚試劑、240 μL 5%碳酸鈉溶液，混勻，恒溫水浴后在745 nm測定吸光度。每個樣品重復(fù)三次?？偡雍恳悦亢辽囵B(yǎng)液含有相當(dāng)沒食子酸的毫克數(shù)表示，即mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次，其結(jié)果以平均數(shù)的形式表示。采用SPSS17.0(IBM公司)統(tǒng)計分析軟件。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的獲得

經(jīng)純化分離獲得10株內(nèi)生真菌，PDA平板培養(yǎng)特征見圖1。由PDA平板培養(yǎng)特征結(jié)合菌絲體生長情況，將內(nèi)生真菌分為3類：第1類包括菌株GS-1、GS-3、GS-5、MD-2、MD-3、MD-5和MD-6，菌絲體呈現(xiàn)棉絮狀，有紫色色素產(chǎn)生。菌絲體生長速度快，28℃恒溫培養(yǎng)5天，菌落直徑達(dá)9 cm；第2類為GS-7和GS-8，菌絲體致密、平鋪呈墊狀，有黃黑色色素產(chǎn)生。菌絲體生長速度慢，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天，菌落直徑約5 cm；第3類為菌株NSZJ-1，白色菌絲體致密、平鋪于培養(yǎng)基表面，背面有棕褐色色素產(chǎn)生。菌絲體生長速度慢，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天，菌落直徑約3～4 cm之間(圖1-1)。由此可見,太子參塊根含有豐富的內(nèi)生真菌資源。

圖1 內(nèi)生真菌在PDA平板上的培養(yǎng)特征Fig.1 The cultural characteristics of endophytic fungi on PDA plate注：1～10：NSZJ-1、GS-1、GS-3、GS-5、GS-7、GS-8、MD-2、MD-3、MD-5、MD-6。

2.2 內(nèi)生真菌的致病性

室內(nèi)新鮮太子參塊根接種致病情況表明，菌株NSZJ-1為非致病內(nèi)生真菌(塊根組織不呈現(xiàn)軟化變褐現(xiàn)象)，而菌株GS-1、GS-3、GS-5、GS-7、GS-8、MD-2、MD-3、MD-5和MD-6均為致病內(nèi)生真菌(塊根組織呈現(xiàn)軟化變褐現(xiàn)象)，其感染致病太子參塊根狀況見圖2。受致病內(nèi)生真菌感染的塊根出現(xiàn)腐爛壞死狀，且菌絲體在塊根上生長旺盛(圖2-4)，而非致病內(nèi)生真菌接種后的塊根則無上述變化(圖2-2)。由此可見，外觀呈現(xiàn)無感病狀態(tài)的太子參塊根其內(nèi)部潛伏存在有病原真菌的侵染。

圖2 內(nèi)生真菌對太子參塊根致病情況測試Fig.2 Assays on pathogenicity of endophytic fungi on root tuber of Pseudostellaria heterophylla注：1和3為對照；2和4為接種內(nèi)生真菌。Note:1 and 3 are controls;2 and 4 are inoculated with endophytic fungi.

2.3 內(nèi)生真菌的鑒定

由試驗結(jié)果“2.1”得到的第1類內(nèi)生真菌產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為單瓶梗，有大型鐮刀狀分生孢子和小型分生孢子，且有紫色素產(chǎn)生，初步確定為鐮刀菌類(Fusariumsp.)；第2類內(nèi)生真菌產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)輪枝分支，有球形分生孢子，且有黑色素產(chǎn)生，初步鑒定為輪枝孢菌類(Verticilliumsp.)；第3類內(nèi)生真菌NSZJ-1產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為單瓶?；蜉喼Ψ种В写笮椭鶢罘稚咦?多為3分隔，平直)和厚垣孢子形成(圖3)。ITS序列分析表明其與Cylindrocarponsp.(AB369260.1)、Dactylonectriapauciseptata(LC427841.1)、Cylindrocarponpauciseptata(JF735305.1)和Ilyonectriaradicicola(HM214452.1)有100%同源性(系統(tǒng)進(jìn)化樹自展值為99%，見圖4)，結(jié)合菌株NSZJ-1在PDA上的培養(yǎng)特征以及大型分生孢子的隔膜數(shù)、小型分生孢子和厚垣孢子的有無以及參考文獻(xiàn)[12]，將內(nèi)生菌NSZJ-1鑒定為柱孢屬(Cylindrocarponsp.)。

圖3 內(nèi)生菌NSZJ-1菌絲體及孢子形態(tài)顯微結(jié)構(gòu)(×10)Fig.3 Microscopic structures of mycelia and spores of endophytic fungus NSZJ-1 (×10)

圖4 基于 rDNA ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建(鄰接法)Fig.4 The construction of phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence (neighbour joining method)

2.4 內(nèi)生真菌NSZJ-1的抗氧化活性

內(nèi)生真菌振蕩培養(yǎng)、去除菌體后，不同極性粗提物DPPH自由基清除能力和羥自由基(·OH)清除能力測定結(jié)果見圖5和6。從圖5和6中可看出，在各相粗提物測試濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，DPPH自由基和羥自由基(·OH)清除率增加。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物清除DPPH自由基、羥自由基(·OH)的IC50值分別為270.537、27.189、2.061、0.672、6.181 mg/mL和946.221、39.957、9.466、1.053和11.270 mg/mL，由此可見，內(nèi)生真菌抗氧化物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物中，且正丁醇提取物抗氧化性最強，其次為乙酸乙酯提取物。1 mmol/L 抗壞血酸的DPPH自由基和羥自由基(·OH)清除率分別為96%和95.1%。

2.5 內(nèi)生真菌NSZJ-1抗氧化成分多酚測定

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物總多酚含量用沒食子酸當(dāng)量(mg/mL)來表示，分別為0.000 1、0.002 9、0.005 5、0.018 6、0.011 1 mg/mL。內(nèi)生真菌NSZJ-1多酚主要集中在正丁醇提取物中，其次為乙醇提取物中，再者為乙酸乙酯提取物，而在二氯甲烷提取物中多酚的含量約為前三者的15%～50%，石油醚提取物中多酚含量幾乎為0；二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物中多酚含量與DPPH自由基和羥自由基清除率的關(guān)系分別見圖7和8。

圖5 不同極性有機提取物對DPPH清除能力Fig.5 The scavenging capacities of different polar extracts on DPPH radical

圖6 不同極性有機提取物對羥自由基清除能力Fig.6 The scavenging capacities of different polar extracts on hydroxyl radical

在一定范圍內(nèi)，多酚對DPPH自由基和羥自由基的清除率隨其濃度的增加而增強。二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物中多酚清除DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.966、0.949、4.138、1.677 μg/mL和3.353、4.415、6.241、2.710 μg/mL。

圖7 不同有機提取物中多酚含量與DPPH自由基清除率的關(guān)系Fig.7 Relationship between the contents of polyphenols in different organic phase extracts and DPPH radical scavenging efficiency注：A：二氯甲烷；B：乙酸乙酯；C：正丁醇；D：乙醇。Note:A:Dichloromethane;B:Ethyl acetate;C:n-Butanol;D:Ethanol.

圖8 不同有機提取物中多酚含量與羥自由基清除率的關(guān)系Fig.8 Relationship between the contents of polyphenols in different organic phase extracts and hydroxyl radical scavenging efficiency

3 討論

目前已從藥用植物中獲得具有抗細(xì)菌、真菌、病毒、氧化、腫瘤、糖尿病和利什曼病等作用的眾多內(nèi)生真菌，因而有望被用于臨床藥物開發(fā)研究中。本研究從貴州道地藥材基地采取太子參分離獲得的內(nèi)生真菌NSZJ-1為柱孢屬(Cylindrocarponsp.)明顯不同于福建產(chǎn)地太子參分離得到的內(nèi)生真菌(DPPH自由基清除的IC50值相差很大)[7]，進(jìn)而說明宿主植物棲息地點對內(nèi)生真菌的寄主專一性有影響[13]。

對于藥用植物內(nèi)生真菌代謝物抗氧化研究方面，前人已有諸多報道。Septiana等[14]從Curcumalonga葉中分離得到的內(nèi)生真菌Bo.Ci.Cl.D1和Bo.Ci.Cl.D2，其乙酸乙酯提取物對DPPH自由基清除的IC50值分別為24.04和96.08 mg/mL，多酚含量分別為113.47和81.83 mg/g，該結(jié)果表明提取物多酚含量與其清除DPPH自由基能力正相關(guān)，同時也間接暗示了這類物質(zhì)是主要的抗氧化劑。關(guān)于藥用植物內(nèi)生真菌抗氧化研究，以往大多研究集中在乙酸乙酯提取物方面[15,16]，且發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的抗氧化能力與其代謝物全酚含量正相關(guān)[15]。Sorout和Arunachalam[17]從藥用植物Azadirachtaindica中分離得到5株內(nèi)生真菌，不同內(nèi)生真菌含有的植物化學(xué)成分種類各不相同，其中F5菌株代謝物植物化學(xué)成分種類最多，對其進(jìn)行PDB發(fā)酵培養(yǎng)、有機溶劑提取得到的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯提取物進(jìn)行全酚測定及抗氧化(DPPH自由基清除)試驗，結(jié)果表明：多酚含量為乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物；抗氧化活性為乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物。本研究采用與文獻(xiàn)[17]相同的培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)，獲得了與其相似的抗氧化活性結(jié)果，具體表現(xiàn)在各提取物的IC50值上。Xue等[18]對內(nèi)生真菌代謝物的抗氧化性(DPPH自由基和羥自由基)研究表明，3個內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物有較強的DPPH自由基清除能力，但對羥自由基的清除能力卻很弱，本研究結(jié)果表明內(nèi)生真菌NSZJ-1的正丁醇提取物有明顯的DPPH自由基、羥自由基清除能力，但進(jìn)一步試驗表明乙酸乙酯提取物中多酚具有較強的DPPH自由基清除能力，乙醇提取物中的多酚具有較強的羥自由基清除能力，造成有機溶劑粗提物與多酚類物質(zhì)對自由基清除結(jié)果不一致的原因可能是內(nèi)生真菌還可能產(chǎn)生多酚類之外的其它類抗氧化物質(zhì)。

目前除了本研究從太子參塊根中分離得到柱孢屬(Cylindrocarponsp.)內(nèi)生真菌外，也有文獻(xiàn)報道從藥用植物Parispolyphyllavar.yunnanensis[19]、Sapiumellipticum[20]和Saussureainvolucrate[21]等中分離得到此屬內(nèi)生真菌，且相關(guān)文獻(xiàn)報道此屬內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生一些新結(jié)構(gòu)化合物[20]，為此今后有必要對太子參內(nèi)生真菌NSZJ-1代謝物進(jìn)行單體分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性開展研究，為天然藥物開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。