芪藶參萸益心方通過減輕炎癥反應(yīng)、溶酶體功能和抑制NLRP3炎癥小體激活來發(fā)揮對心肌梗死大鼠的保護作用

盧 超，石孟瓊，張媛媛，羅 恒，陳臘年，任俊紅，舒 恒，張繼紅*

1三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院&宜昌市二醫(yī)院；2三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室&三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，宜昌 443002

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心血管疾病的致死性表現(xiàn)之一。它是由于富含脂質(zhì)的斑塊破裂和血栓形成所導(dǎo)致的冠狀動脈供血和心肌需求之間的不平衡造成的。這兩種情況都會對心肌的某些部位造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷；臨床上常見為冠狀動脈病變引起心肌供血不足，造成心肌嚴重功能障礙，甚至壞死。在導(dǎo)致斑塊破裂的眾多致病性誘因中，炎癥是MI發(fā)病的主要危險因素之一，在它MI發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[1,2]。

在許多炎癥途徑中，心肌缺血后細胞內(nèi)釋放的溶酶體酶可能直接或通過激活補體途徑導(dǎo)致細胞損傷和死亡[3]。溶酶體酶的釋放在激活核苷酸結(jié)合區(qū)、富含亮氨酸家族和吡喃結(jié)構(gòu)域-3(NLRP3)炎癥小體[4]。此外，心肌梗死患者溶酶體酶活性的變化已被發(fā)現(xiàn)[5]。細胞因子是炎癥介質(zhì)，通過動脈粥樣硬化的形成和動脈粥樣硬化損傷的快速演變，觸發(fā)斑塊破裂和腔內(nèi)血栓形成[6]。促炎細胞因子在急性心肌損傷和梗死中升高，并在MI后升高他們對與冠狀動脈疾病相關(guān)的全身和血管炎癥的發(fā)生和維持負有高度責(zé)任[7]。Toll樣受體(TLRs)可能通過激活核因子kappa B(NF-κB)信號途徑參與NLRP3炎癥小體的蛋白表達，以及白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)的前體[8]。在通過包括NF-κB激活在內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑釋放多種炎性細胞因子中，NF-κB是NLRP3基因轉(zhuǎn)錄的傳統(tǒng)啟動信號。近年來研究表明NF-κB信號通路在缺血情況下調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的表達和活化中起著關(guān)鍵作用[9]。NLRP3炎癥小體是一種重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，NLRP3蛋白通過PYD-PYD結(jié)構(gòu)域的相互作用招募調(diào)亡相關(guān)的斑點樣蛋白(ASC)，銜接蛋白ASC再通過CARD-CARD結(jié)構(gòu)域的相互作用招募pro-caspase-1，結(jié)合形成炎癥小體。這導(dǎo)致caspase-1活化，將pro-IL-1β和pro-IL-18剪切成成熟的(IL-1β和IL-18)形式，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10]。此外，在氧化應(yīng)激過程中，觸發(fā)ROS的過度產(chǎn)生，促進硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)與NLRP3的結(jié)合并激活NLRP3炎癥小體[11]。

芪藶參萸益心方是我們根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗總結(jié)出來的經(jīng)驗方，前期臨床試驗它可增加心衰患者的每分鐘心排血量、提高左室射血分數(shù)、減慢因心功能不全產(chǎn)生的臨床癥狀和體征[12,13]；動物實驗研究發(fā)現(xiàn)芪藶參萸益心方對心衰所致的心肌損傷具有較好的心肌保護作用，可上調(diào)心衰大鼠心肌組織中Sirt1、胞核中Nrf2、Bcl-2蛋白表達和MnSOD、HO-1、NQO1、GCLC mRNA表達，下調(diào)Ac-FoxO1和Ac-Pgc-1α蛋白表達及上調(diào)Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspas-3蛋白表達，升高Bcl-2/Bax比率，并初步證實其作用機制可能與其激活Sirt1/FoxO1/Pgc-1α和Nrf2/抗氧化通路有關(guān)[14,15]。本研究擬在此基礎(chǔ)上，圍繞炎癥反應(yīng)、溶酶體功能和炎癥小體激活來觀察芪藶參萸益心方對MI大鼠的影響，探尋其可能的作用機制，為其臨床應(yīng)用于MI的防治提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠120只，體質(zhì)量200±20 g，由三峽大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2017-0012，分籠飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。所有涉及動物使用的實驗程序都是按照三峽大學(xué)動物護理委員會的指導(dǎo)方針和在動物倫理委員會(倫理審查批號：CTGUEAC-2019-079)的監(jiān)督下進行。

1.2 藥物

芪藶參萸益心方[黃芪(批號190205)30 g、葶藶子(批號181126)15 g、山茱萸(批號190127)20 g、北五加皮(批號181209)10 g、大棗(批號181213)20 g、桂枝(批號190128)15 g、煅龍牡各(批號181024、180513)15 g、丹參(批號190221)20 g]均為藥典規(guī)定的藥材品種，經(jīng)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學(xué))汪鋆植教授進行了鑒定，并在實驗室留有藥材標本。芪藶參萸益心方提取物的制備方法參見我們前期介紹的方法[15]。鹽酸地爾硫卓片(天津田邊制藥，批號：20190829，每片30 mg)。實驗時，所用藥物分別用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配成相應(yīng)濃度藥物混懸液，備用。

1.3 主要試劑及儀器

活性氧自由基(ROS)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(南京建成)；β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D試劑盒(北京百奧萊博)；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10 ELISA試劑盒(深圳達科為)；TLR4、MyD88、iNOS、COX-2、GAPDH引物合成(熒光定量PCR引物序列見表1)，Trizol和DEPC(上海生工)；Prime Script TM RT reagent Kit、Taq DNA聚合酶(大連寶生物)；IKKβ、p-IKKβ、IκBα、p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18一抗(美國Santa Cruz)；β-actin一抗及二抗(武漢博士德)；組織蛋白和胞漿、胞核蛋白提取及ECL發(fā)光試劑盒(南京碧云天)；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。電子天平(梅特勒-托利多)；手術(shù)無影燈(上海醫(yī)達)；數(shù)字展示臺(日本Victor)；多導(dǎo)生理記錄儀(美國Biopac)；渦旋儀(美國奧然)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf)；酶聯(lián)免疫檢測儀(瑞士Tecan)；脫水機，顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(德國Leica)；超薄切片機(奧地利萊卡)；實時定量PCR儀(美國Illumina)；核酸測定儀(美國Thermo)；電泳儀(北京六一)。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in quantitative real-time PCR

2 實驗方法

2.1 大鼠MI的建立及給藥

根據(jù)Wei等[16]報道方法制作MI大鼠模型。術(shù)后次日將模型大鼠完全隨機分為模型組、芪藶參萸益心方28.8 g/kg劑量組(根據(jù)臨床用藥量，依據(jù)實驗動物與人的體表面積換算關(guān)系計算為成人2倍量，28.8生藥 g/kg)、芪藶參萸益心方57.6 g/kg劑量組(根據(jù)臨床用藥量，依據(jù)實驗動物與人的體表面積換算關(guān)系計算為成人4倍量，57.6生藥 g/kg)和鹽酸地爾硫卓0.016 g/kg組(根據(jù)臨床用藥量，依據(jù)實驗動物與人的體表面積換算關(guān)系計算約為成人2倍量，0.016 g/kg)及假手術(shù)組，每組16只。各組大鼠灌胃給予相應(yīng)的藥物，灌胃體積為10 mL/kg，模型組和假手術(shù)組灌胃給予相應(yīng)體積的0.5% CMC-Na，每天1次，連續(xù)給藥4周。

2.2 心功能的測定

末次給藥的次日，實驗大鼠分別用20%氨基甲酸乙酯溶液(1.5 g/kg，i.p)麻醉后，頸部切開，分離右側(cè)頸總動脈，進行頸總動脈和左心室插管，記錄頸總動脈壓1次，再進入左心室，用Biopac系統(tǒng)記錄血流動力學(xué)指標(心率：heart rate，HR；左心室收縮壓：left ventricular systolic pressure，LVSP；左心室舒張末壓：left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP；左室內(nèi)壓上升最大速率：maximal rate of the increase of left ventricular pressure，LV+dp/dtmax；左室內(nèi)壓下降最大速率：maximal rate of the decrease of left ventricular pressure，LV-dp/dtmin)。

2.3 標本采集及檢測

2.3.1 標本采集

測定完實驗大鼠心功能后，腹腔主動脈取血，分離血清，用于相關(guān)指標檢測；取血完畢后，取出大鼠心臟，用生理鹽水洗去殘留血液，用潔凈紗布吸干水分，稱全心質(zhì)量；每組隨機選取8只大鼠心臟心肌梗死面積計算，然后隨機選取3只大鼠心臟用于病理學(xué)指標檢測，其余部分存儲于-80 ℃冰箱，用于蛋白及基因表達檢測。

2.3.2 血液中ROS含量測定

根據(jù)Hayashi等[17]介紹的方法進行血液中ROS含量檢測。

2.3.3 血液中生化指標測定

按試劑盒說明書的方法測定血液中LDH、SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

2.3.4 血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10含量測定

按ELISA試劑盒說明書的方法測定血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10含量。

2.3.5 血液、心肌組織和溶酶體中溶酶體酶的測定

根據(jù)Sathish等[18]介紹的方法分離溶酶體和胞質(zhì)，然后根據(jù)Nagoor等[19]介紹的方法，分別測定血液、心臟組織、溶酶體中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、組織蛋白酶B和組織蛋白酶D的活性。

2.3.6 心臟質(zhì)量指數(shù)測定及MI面積計算

全心重，計算心臟質(zhì)量指數(shù)[心臟質(zhì)量指數(shù)=全心重量(mg)/體重(g)]；然后隨機選取每組一半大鼠的心臟，按照我們已發(fā)表文章[15]介紹的方法計算MI面積。

2.3.7 心臟組織形態(tài)學(xué)分析

將隨機選取3只大鼠心臟，沿長軸從心尖到心底橫切成五等份，選取中間等分，置于4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水、石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色后置于顯微鏡下觀察心臟組織形態(tài)。

2.3.8 Real-time PCR檢測

按照RNA提取試劑盒說明書介紹的方法提取左心室心肌組織RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后按照此反應(yīng)體系[SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ (2X) 12.5 μL，PCR Forward Primer(10 μM)1 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)1 μL，DNA模板2 μL，滅菌蒸餾水8.5 μL]在Real-time PCR擴增儀中按95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、退火30 s、72 ℃延伸20 s條件擴增40次。利用PCR儀匯出擴增曲線，進行結(jié)果分析。

2.3.9 Western blot檢測

按照胞漿和胞核蛋白提取試劑盒說明書介紹的方法提取左心室心肌組織胞漿蛋白和胞核蛋白、按蛋白提取試劑盒說明書介紹的方法提取左心室心肌組織蛋白，經(jīng)核酸測定儀測定蛋白含量后，用10%～15%聚丙烯酰胺凝膠在120 V、28 mA條件下電泳1.5 h，然后轉(zhuǎn)膜2 h；5%脫脂牛奶封閉，滴加IKKβ、p-IKKβ、IκBα、p-IκBα、NF-κBp65、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和β-actin一抗(1∶300、1∶300、1∶400、1∶400、1∶300、1∶400、1∶400、1∶300、1∶400、1∶400、1∶300、1∶300、1∶500)，4 ℃孵育過夜；用含0.1% Tween 20的TBS沖洗后，滴加二抗(1∶1 000)后在室溫下孵育2 h，然后用0.1% TBST沖洗后，X光片顯影，掃描圖像，用圖像分析軟件分析其蛋白表達。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 芪藶參萸益心方對MI大鼠心功能的影響

模型組大鼠LVSP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmin顯著降低，LVEDP明顯升高，與假手術(shù)組大鼠比較具有顯著性差異(P<0.01)；用芪藶參萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地爾硫卓(0.016 g/kg)治療后，各給藥組LVSP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmin顯著升高，LVEDP明顯降低，且隨著芪藶參萸益心方劑量的增加，其作用效果愈加顯著，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，其中芪藶參萸益心方57.6 g/kg組作用效果強于地爾硫卓組(0.016 g/kg)，但各組之間心率沒有明顯的差異，結(jié)果見表2。

3.2 芪藶參萸益心方對MI大鼠血液中ROS、LDH和氧化應(yīng)激指標的影響

模型組大鼠血液中LDH活性和ROS、MDA含量明顯增加，SOD、CAT和GSH-Px活性顯著降低，與假手術(shù)組大鼠比較具有顯著性差異(P<0.01)；用芪藶參萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地爾硫卓(0.016 g/kg)治療后，各給藥組LDH活性和ROS、MDA含量明顯降低，SOD、CAT和GSH-Px活性顯著升高，且隨著芪藶參萸益心方劑量的增加，其作用效果愈加顯著，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，其中芪藶參萸益心方57.6 g/kg組作用效果強于地爾硫卓組(0.016 g/kg)，結(jié)果見表3。

表2 芪藶參萸益心方對MI大鼠心功能的影響Table 2 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on cardiac function in rats with myocardial infarction

表3 芪藶參萸益心方對MI大鼠血液中ROS、LDH和氧化應(yīng)激指標的影響Table 3 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on the blood ROS,LDH and oxidativestress in rats with myocardial infarction

3.3 芪藶參萸益心方對MI大鼠血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10含量的影響

模型組大鼠血液中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量明顯升高，抗炎因子IL-4、IL-10含量明顯降低，與假手術(shù)組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用芪藶參萸益心方(28.8和57.6 g/kg)和地爾硫卓(0.016 g/kg)治療后，上述異常改變的細胞因子得到有效逆轉(zhuǎn)，且隨著芪藶參萸益心方劑量的增加，其作用效果愈加顯著，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，其中芪藶參萸益心方57.6 g/kg組作用效果強于地爾硫卓組(0.016 g/kg)，結(jié)果見表4。

表4 芪藶參萸益心方對MI大鼠血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10含量的影響Table 4 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on the blood contents of TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-18,IL-4and IL-10 in rats with myocardial infarction

3.4 芪藶參萸益心方對MI大鼠血液、心肌和溶酶體細胞器中溶酶體酶活性的影響

模型組大鼠血液、心肌中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D活性和溶酶體細胞器胞質(zhì)中β-葡萄糖醛酸酶、組織蛋白酶D的活性明顯升高，溶酶體細胞器溶酶體中β-葡萄糖醛酸酶、組織蛋白酶D的活性明顯降低，與假手術(shù)組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用芪藶參萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地爾硫卓(0.016 g/kg)治療后，上述異常改變的溶酶體酶活性被有效逆轉(zhuǎn)，且隨著芪藶參萸益心方劑量的增加，其作用效果愈加顯著，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，其中芪藶參萸益心方57.6 g/kg組作用效果強于地爾硫卓組(0.016 g/kg)，結(jié)果見表5。

表5 芪藶參萸益心方對MI大鼠血液、心肌和溶酶體細胞器中溶酶體酶活性的影響或n=8)Table 5 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on activities of lysosomal in the blood,heart tissue and subcellular fractionsin rats with myocardial infarction or n=8)

3.5 芪藶參萸益心方對MI大鼠心臟重量指數(shù)和心肌梗死面積的影響

由圖1和圖2可見，模型組大鼠心臟重量指數(shù)和心肌梗死面積明顯增加，與假手術(shù)組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用芪藶參萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地爾硫卓(0.016 g/kg)治療后，心臟重量指數(shù)和心肌梗死面積明顯降低，且隨著芪藶參萸益心方劑量的增加，其作用效果愈加顯著，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，其中芪藶參萸益心方57.6 g/kg組作用效果強于地爾硫卓組(0.016 g/kg)。

3.6 芪藶參萸益心方對MI大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)的影響

如圖3所示，假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常，核正常，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠心肌組織表現(xiàn)為廣泛的心肌結(jié)構(gòu)紊亂和破裂，心肌纖維呈壞死和波浪狀，細胞核消失；用芪藶參萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地爾硫卓(0.016 g/kg)治療后，可顯著減少壞死程度和炎性細胞浸潤，且隨著芪藶參萸益心方劑量的增加，其作用效果愈加顯著。

3.7 芪藶參萸益心方對MI大鼠心肌中TLR4、MyD88、iNOS、COX-2 mRNA表達的影響

模型組心肌組織中TLR4、MyD88、iNOS、COX-2 mRNA表達明顯升高，與假手術(shù)組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用芪藶參萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地爾硫卓(0.016 g/kg)治療后，TLR4、MyD88、iNOS、COX-2 mRNA表達明顯降低，且隨著芪藶參萸益心方劑量的增加，其作用效果愈加顯著，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，其中芪藶參萸益心方57.6 g/kg組作用效果強于地爾硫卓組(0.016 g/kg)，結(jié)果見表6。

圖1 芪藶參萸益心方對MI大鼠心臟外觀形態(tài)的影響Fig.1 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on cardiac appearance and morphology in rats with myocardial infarction注：1：假手術(shù)組；2：模型組；3：芪藶參萸益心方28.8 g/kg組；4：芪藶參萸益心方57.6 g/kg組；5：地爾硫卓組。Note:1:Sham group;2:Model group;3:Qili Shengyu Yixin Formula 28.8 g/kg group;4:Qili Shengyu Yixin Formula 57.6 mg/kg group;5:Diltiazem group.

圖2 芪藶參萸益心方對MI大鼠心臟重量指數(shù)和心肌梗死面積的影響Fig.2 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on the cardiac weight index and myocardial infarct size in rats with myocardial infarction

圖3 芪藶參萸益心方對MI大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)的影響(HE染色)Fig.3 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the histomorphology in rats with myocardial infarction (Hematoxylin and eosin)注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：芪藶參萸益心方28.8 g/kg組；D：芪藶參萸益心方57.6 g/kg組；E：地爾硫卓組。Note:A:Sham group;B:Model group;C:Qili Shengyu Yixin Formula 28.8 g/kg group;D:Qili Shengyu Yixin Formula 57.6 mg/kg group;E:Diltiazem group.

表6 芪藶參萸益心方對MI大鼠心肌中TLR4、MyD88、iNOS、COX-2 mRNA表達的影響Table 6 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the mRNA expressions of TLR4,MyD88,iNOS and COX-2in myocardial tissue of rats with myocardial infarction

3.8 芪藶參萸益心方對MI大鼠心肌中NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

模型組心肌中胞漿p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核NF-κBp65蛋白表達明顯上調(diào)，p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα比值明顯增加，胞漿NF-κBp65蛋白表達明顯下調(diào)，與假手術(shù)組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用芪藶參萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地爾硫卓(0.016 g/kg)治療后，心肌組織中胞漿p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核NF-κBp65蛋白表達明顯下調(diào)，p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα比值明顯減少，胞漿NF-κBp65蛋白表達明顯上調(diào)，且隨著芪藶參萸益心方劑量的增加，其作用效果愈加顯著，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。各組間IKKβ和IκBα蛋白表達無顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果見表7～9和圖4。

表7 芪藶參萸益心方對MI大鼠心肌中IKK復(fù)合物中相關(guān)蛋白表達的影響Table 7 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the IKK complex related protein expressions inmyocardial tissue of rats with myocardial infarction

表8 芪藶參萸益心方對MI大鼠心肌中NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Table 8 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the protein expressions of NF-κB/NLRP3 signaling pathwayin myocardial tissue of rats with myocardial infarction

表9 芪藶參萸益心方對MI大鼠心肌中炎癥因子蛋白表達的影響Table 9 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the protein expressions of inflammatory factors in myocardialtissue of rats with myocardial infarction

圖4 芪藶參萸益心方對MI大鼠心肌中NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the protein expressions of NF-κB/NLRP3 signaling pathway in myocardial tissue of rats with myocardial infarction注：1：假手術(shù)組；2：模型組；3：芪藶參萸益心方28.8 g/kg組；4：芪藶參萸益心方57.6 g/kg組；5：地爾硫卓組。Note:1:Sham group;2:Model group;3:Qili Shengyu Yixin Formula 28.8g/kg group;4:Qili Shengyu Yixin Formula 57.6 mg/kg group;5:Diltiazem group.

4 討論

MI后炎癥是近年來心血管研究的熱點，它影響缺血心臟的重塑過程，從而嚴重影響患者的臨床預(yù)后。適度的炎癥反應(yīng)可以縮小心肌梗死范圍，促進受損心肌的修復(fù)，然而過度炎癥可能產(chǎn)生有害影響，并可能導(dǎo)致與心力衰竭風(fēng)險增加相關(guān)的不良心室重塑[20]。因此，減輕炎癥反應(yīng)在改善MI心肌損傷，促進心肌功能恢復(fù)中具有重要意義。近年來，我們在臨床試驗和動物的實驗研究時發(fā)現(xiàn)，芪藶參萸益心方對心肌損傷具有較好的治療作用，并證實抑制心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷恢復(fù)受損心肌功能可能是其發(fā)揮作用機制之一[14,15]。本實驗將在此基礎(chǔ)上，通過冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠MI模型，觀察芪藶參萸益心方對炎癥反應(yīng)、溶酶體功能和炎癥小體活性的影響，在此基礎(chǔ)上探尋其可能的作用機制，為此我們進行了本實驗。實驗結(jié)果表明，芪藶參萸益心方可顯著改善MI大鼠心功能、降低心臟重量指數(shù)和梗死面積，減少心肌壞死程度和炎性細胞浸潤；降低血清、心肌中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D活性和溶酶體細胞器胞質(zhì)中β-葡萄糖醛酸酶、組織蛋白酶D的活性，升高溶酶體細胞器溶酶體中β-葡萄糖醛酸酶、組織蛋白酶D的活性；降低血液中LDH活性、ROS、MDA和TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量，升高血液中SOD、CAT和GSH-Px活性和IL-4、IL-10含量；下調(diào)心肌中iNOS、COX-2、TLR4、MyD88 mRNA表達，下調(diào)心肌胞漿中p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核NF-κBp65蛋白表達，降低p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα比值，上調(diào)心肌胞漿中NF-κBp65蛋白表達。上述結(jié)果表明，芪藶參萸益心方可通過抑制炎癥反應(yīng)、溶酶體功能和炎癥小體激活功能來發(fā)揮對MI大鼠的治療作用。

眾所周知，ROS的產(chǎn)生是細胞正常代謝的一部分，此時產(chǎn)生的ROS會被細胞內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)所清除，但是當(dāng)細胞缺氧所致氧化應(yīng)激會引起ROS的過量產(chǎn)生和異常積累，會導(dǎo)致膜脂類、蛋白質(zhì)、碳水化合物和DNA的氧化損傷。因此ROS也被認為是心肌損傷的關(guān)鍵因子[21]。ROS攻擊細胞膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜的完整性，導(dǎo)致LDH等心肌酶滲漏，MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映細胞膜結(jié)構(gòu)和功能上受到損傷的程度[22]。在本研究中，MI大鼠血液中ROS、MDA含量和LDH活性較假手術(shù)組顯著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性明顯降低。上述結(jié)果提示MI引起的心肌損傷導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生。芪藶參萸益心方可顯著升高血液中SOD、GSH-Px和CAT活性，降低LDH活性和ROS、MDA含量，減輕心肌細胞的脂質(zhì)過氧化，進而保持細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性?？傊嗡瀰⑤且嫘姆街饕ㄟ^提高抗氧化酶活性來保護MI所致的心肌損傷。

心肌缺血時產(chǎn)生的ROS除了破壞細胞膜的細胞膜結(jié)構(gòu)和功能外，還可與溶酶體脂質(zhì)雙層膜反應(yīng)，破壞溶酶體膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致溶酶體破裂，酸性水解酶和組織蛋白酶釋放到胞漿和循環(huán)中。酸水解酶從溶酶體釋放到胞質(zhì)中，導(dǎo)致缺血心臟的心肌細胞損傷和死亡[23]。在實驗中，模型組大鼠血清、心肌中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D活性和溶酶體細胞器胞質(zhì)中β-葡萄糖醛酸酶、組織蛋白酶D的活性明顯升高，溶酶體細胞器溶酶體中β-葡萄糖醛酸酶、組織蛋白酶D的活性明顯降低；用芪藶參萸益心方治療后可有效抑制β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D從溶酶體滲漏。

越來越多的證據(jù)表明炎癥在MI的病理生理過程中起著至關(guān)重要的作用[24]。在缺氧條件下，心肌氧化應(yīng)激產(chǎn)生H2O2、超氧陰離子和羥基自由基等一方面被心肌細胞膜上的模式識別受體(PRR)TLR4識別，隨后募集下游的信號蛋白MyD88，形成MyD88-TLR4復(fù)合體，MyD88的死亡結(jié)構(gòu)域與IRAK的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而依次引起IRAK1和IRAK4的自磷酸化，隨后離開MyD88-TLR4復(fù)合體而與TRAF6結(jié)合，導(dǎo)致TRAF6激活，而TRAF6又激活TAK1；TAK1激活I(lǐng)KK復(fù)合體，IKK復(fù)合體被激活后可使其下游分子IκB降解，從而釋放NF-κB的2個亞基：p50和p65，并使p65亞基磷酸化，磷酸化p65在有核定位信號p50的幫助下進入細胞核，從而啟動炎癥反應(yīng)免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，表達與分泌IL-6、TNF-α炎癥因子及無活性的pro-IL-1β、pro-IL-18和NLRP3產(chǎn)生，完成炎癥反應(yīng)信號的傳遞，參與炎性激活、細胞凋亡等病理過程[25,26]。另一方面進入心肌細胞后可被細胞質(zhì)中PRR：NLRP3所識別并促進細胞內(nèi)TXNIP與硫氧蛋白分離，然后與NLRP3結(jié)合，使NLRP3募集ASC和pro-caspase-1，完成無活性的NLRP3炎癥小體組裝；同時還可引起線粒體損傷和溶酶體破裂，導(dǎo)致線粒體內(nèi)容物(mtROS和mtDNA)的釋放或暴露、溶酶體釋放組織蛋白酶B，促進NLRP3炎癥小體結(jié)合并將其激活，誘導(dǎo)pro-caspase-1自我剪切活化，活化的caspase-1使pro-IL-1β、pro-IL-18剪切為活化的IL-1β、IL-18，活化的IL-1β、IL-18刺激心肌細胞，通過自分泌/旁分泌系統(tǒng)分泌多種更多炎癥介質(zhì)、炎癥因子，形成惡性循環(huán)[2,27,28]。由此可見，TLR4/NF-κB通路及下游NLRP3炎癥小體途徑掌控著MI炎癥反應(yīng)，靶向此通路可為MI的治療提供新思路。實驗中，我們發(fā)現(xiàn)MI模型大鼠心肌組織中TLR4、MyD88、iNOS、COX-2、mRNA和心肌組織胞漿中p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核NF-κBp65蛋白表達明顯上調(diào)，p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα比值明顯增加，胞漿NF-κBp65蛋白表達明顯下調(diào)；血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量明顯升高，IL-4、IL-10含量明顯降低；用芪藶參萸益心方治療后上述異常表達得到了有效遏制，實驗提示芪藶參萸益心方可通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路炎性激活，進而抑制炎癥因子發(fā)生發(fā)揮對MI的治療作用。

綜上所述，芪藶參萸益心方對冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠MI有顯著治療作用，其作用機制可能與其增強內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)功能、緩解MI后氧化應(yīng)激及減輕炎癥反應(yīng)、糾正溶酶體功能障礙和抑制NLRP3炎癥小體激活有關(guān)。本研究為芪藶參萸益心方治療MI提供了分子生物學(xué)依據(jù)。