基于SIRT6/NF-κB信號通路研究杠板歸總黃酮對急性肝損傷大鼠的保護作用

連苑宇，徐 杰，朱田田，馬曉輝，曹后康，張可鋒，韋日明*，高 雅*

1桂林醫(yī)學院，桂林 5410041；2甘肅中醫(yī)藥大學，蘭州 730000

急性肝損傷(acute liver injury，ALI)是指在短期內(nèi)由于各種原因?qū)е碌母喂δ芡话l(fā)異常的疾病，為眾多肝臟疾病的起始階段，其發(fā)病機制復雜；藥物中毒、免疫反應(yīng)、病毒感染、缺血-再灌注等導致的急性肝損傷與氧化自由基、炎癥因子和細胞凋亡等密切相關(guān)[1]。綜合國內(nèi)外有關(guān)治療急性肝損傷的研究現(xiàn)狀，西醫(yī)常通過臨床表現(xiàn)和病理學變化診斷肝病，但與臨床實際還有一定的偏差，且臨床上針對各種原因?qū)е碌母螕p傷仍缺乏高效的多靶點的保肝藥物[2]。隨著中醫(yī)對肝病基礎(chǔ)理論和臨床研究的不斷深入，在肝病的預(yù)防治療上漸顯優(yōu)勢，中醫(yī)藥理論對急性肝損傷研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病規(guī)律多為正虛不能抵抗外邪，導致濕熱毒邪由氣入血，血瘀和肝郁氣滯[3]。因此，探索治療急性肝損傷的藥物和研究其作用機制具有重要意義。

炎癥反應(yīng)在急性肝損傷等疾病的治療中受到廣泛重視，其中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是重要的炎癥轉(zhuǎn)錄因子。當肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)時，刺激NF-κB的乙?；瑔覶NF-α、IL-1β、IL-6等下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[4]，并與VCAM-1、MCP-1基因啟動子區(qū)域結(jié)合進行調(diào)控，增加炎癥因子的釋放和炎癥介質(zhì)的合成[5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2(SIR2)是一種廣泛存在于生物體的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙酰化酶，人類中有7個與SIRT2同源的蛋白：SIRT1～SIRT7[6]。SIRT6位于19號染色體的13.3端，分別由8個外顯子和7個外顯子編碼355和328個氨基酸長度的蛋白[7]，通過去乙?；揎椚旧|(zhì)上包括NF-κB在內(nèi)的許多基因組蛋白的H3K9位點發(fā)揮抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用，從而下調(diào)炎癥因子的表達起到抗炎的作用[8]。

杠板歸為蓼科蓼屬植物杠板歸(PolygonumperfoliatumL.)的全草，用于治療黃疸、腎炎水腫、乳腺炎、百日咳、慢性濕疹、毒蛇咬傷、濕熱黃疸等癥，具有抗菌、抗病毒、抗誘變、降血壓、抗腫瘤、止血等療效[9]。廣西壯族民間常用于肝臟疾病的防治。近年來，本課題組為了確定杠板歸防治肝病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，在準確鑒別杠板歸藥材的基礎(chǔ)上，已對其中具有保肝、抗肝損傷的活性成分總黃酮進行了系統(tǒng)的藥效學、病理學和化學成分提取分離與含量測定研究[10,11]，實驗證實TFP能夠降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，增強抗氧化酶如總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，其機制可能與其抗氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、提高機體免疫、降低炎性介質(zhì)水平等作用有關(guān)。

本實驗根據(jù)上述病機及發(fā)病特點，旨在探索TFP對四氯化碳(CCl4)致急性肝損傷大鼠的保護作用，并從氧化應(yīng)激和炎癥方面探討其保肝作用機制，為TFP的開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

健康SPF級6～8周齡SD大鼠70只，雌性，體重200±20g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 實驗藥物及試劑

杠板歸總黃酮(制備方法見[12])；水飛薊素(美侖生物技術(shù)有限公司)；四氯化碳CCl4(廣東汕頭市西隴化工廠)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)試劑盒(武漢Elabscience生物技術(shù)有限公司)；NF-κB p65、p-NF-κB p65、SIRT6、VCAM-1、MCP-1抗體(英國Abcam公司)；RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(南通市碧云天生物技術(shù)研究所)；PVDF膜(美國 Millipore公司)；抗β-actin單抗、辣根酶標記的二抗、DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Super ECL Plus超敏發(fā)光液(南通市碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.4 儀器

Epoch 2HS酶標儀(美國Bio-Tek公司)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Tek公司)；AUW220D半微量電子天平(日本島津公司)；FRESCO 21高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BX51光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

2 方法

2.1 動物分組與造模

將70只SD大鼠隨機分為正常組、TFP對照組(200 mg/kg)、CCl4模型組、CCl4+水飛薊素組(120 mg/kg)及CCl4+TFP高、中、低劑量組(200、100、50 mg/kg)，每組10只。除正常組和CCl4模型組灌胃(8 mL/kg)蒸餾水外，TFP對照組、CCl4+水飛薊素組和CCl4+TFP高、中、低劑量組分別灌胃相應(yīng)劑量的藥物(8 mL/kg)，連續(xù)10天。末次給藥后，除正常組和TFP對照組，其余各組均腹腔注射12%的CCl4橄欖油溶液(5 mL/kg)，建立急性肝損傷大鼠模型。禁食不禁水16 h后，眼球取血，血液于4 ℃、4 500 rpm離心15 min，分離血清于-20 ℃保存，采集肝組織。

2.2 肝組織病理切片檢查

取大鼠肝組織，用4%多聚甲醛固定48 h，使用梯度濃度(75%、85%、95%、無水)乙醇及二甲苯進行常規(guī)脫水，石蠟包埋。將肝組織蠟塊制作為4 μm厚度的切片，進行HE染色。染色后將切片置于光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

2.3 肝功能指標檢測

將血漿置于離心機分離血清(4 ℃、4 500 rpm、15 min)，保存在-20 ℃?zhèn)溆?。生化法檢測血清中ALT、AST、ALP、TBIL、γ-GT、T-SOD、GSH-Px、MDA活性和水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。各指標測定均按照試劑盒說明書操作，使用Epoch 2HS酶標儀進行測定。

2.4 免疫組化

將制備好的4 μm組織切片置于37 ℃恒溫烘箱中過夜，二甲苯脫蠟3次，每次3 min。切片依次浸入梯度濃度乙醇中水化，置于抗原修復液枸櫞酸鈉中高壓修復抗原4 min，修復后切片冷卻至室溫，將切片置于內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑10 min。PBS沖洗后滴加一抗p-NF-κB p65于組織切片，37 ℃恒溫孵育1 h，PBS潤洗3次，滴加二抗孵育1 h。最后滴加diaminobenzidine(DAB)顯色液孵育3～5 min，蘇木素染色、鹽酸酒精分化后流水反藍，脫水后封片，置于光學顯微鏡下觀察表達情況。每個標本在200倍光鏡下隨機選取8個視野，采用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)在鏡下計算它們在整個肝組織區(qū)域中的平均陽性面積及平均吸光度(A)值。

2.5 蛋白免疫印跡法實驗(Western blot)

檢測肝組織中SIRT6、NF-κB p65、p-NF-κB p65、VCAM-1、MCP-1蛋白表達水平，取大鼠肝組織相同部位60 mg，加入RIPA裂解液1 mL于研磨管，冰浴充分研磨制備組織勻漿，待組織完全裂解后將勻漿轉(zhuǎn)移到EP管(14 000 rpm、4 ℃)離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白含量。配制濃度為10%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣后進行SDS-PAGE電泳，調(diào)節(jié)至80 V恒壓電泳，待指示劑到達分離膠與濃縮膠交界處時，切換為120 V恒壓電泳；電泳結(jié)束后，在冰浴條件下300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉2 h，TBST潤洗3次后加入一抗4 ℃孵育過夜；第二天取出后，用TBST潤洗3次，加入二抗，4 ℃孵育1.5 h，經(jīng)ECL化學發(fā)光法顯色后，使用全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)檢測，Image J軟件統(tǒng)計分析蛋白灰度，計算目的蛋白相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 TFP對CCl4致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST活性的影響

結(jié)果如表1所示，與正常組比較，CCl4模型組大鼠血清ALT、AST水平顯著升高(P<0.01)，TFP對照組ALT、AST水平無統(tǒng)計學意義。與CCl4模型組比較，CCl4+TFP高、中劑量組ALT、AST水平顯著降低(P<0.01)，CCl4+TFP低劑量組ALT、AST水平降低(P<0.05)。

3.2 TFP對CCl4致急性肝損傷大鼠血清ALP、TBIL、γ-GT活性的影響

結(jié)果如表2所示，與正常組比較，模型組大鼠血清ALP、TBIL、γ-GT水平顯著升高，TFP對照組大鼠血清ALP、TBIL和γ-GT水平無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，TFP高、中劑量組ALP、TBIL、γ-GT水平顯著降低(P<0.01)，TFP低劑量組ALP、TBIL水平降低(P<0.05),γ-GT水平無統(tǒng)計學意義。

表1 TFP對大鼠血清中ALT、AST的影響Table 1 The effects of TFP on the serum ALT and AST

表2 TFP對大鼠血清中ALP、TBIL、γ-GT的影響Table 2 The effects of TFP on the serum ALP,TBIL and γ-GT

3.3 TFP對CCl4致急性肝損傷大鼠血清T-SOD、GSH-Px和MDA的影響

結(jié)果如表3所示，與正常組相比，模型組大鼠血清T-SOD和GSH-Px活性顯著降低，MDA水平顯著升高，TFP對照組T-SOD、GSH-Px活性和MDA水平無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，TFP高、中劑量組MDA水平顯著降低(P<0.01)，T-SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.01)。TFP低劑量組MDA水平降低(P<0.05)，T-SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)。

表3 TFP對大鼠血清MDA、T-SOD和GSH-Px的影響Table 3 The effects of TFP on the serum MDA,T-SOD and GSH-Px

3.4 TFP對CCl4致急性肝損傷大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

結(jié)果如表4所示，與正常組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，TFP高、中劑量組TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著降低(P<0.01)，TFP低劑量組除IL-6含量無統(tǒng)計學意義外，TNF-α、IL-1β含量降低(P<0.05)。

表4 TFP對大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響Table 4 The effects of TFP on the serum TNF-α,IL-1β and IL-6

3.5 TFP對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織病理學形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞索呈放射狀整齊排列，匯管區(qū)及中央靜脈周圍肝細胞形態(tài)清晰完整，細胞核位于肝細胞中央，且大小形態(tài)均一。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)已嚴重損壞，肝細胞有大面積的空泡變形，匯管區(qū)及中央靜脈周圍出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤和肝細胞壞死，該結(jié)果提示CCl4可引起大鼠肝損傷。與模型組比較，水飛薊素組和TFP各劑量組肝細胞空泡數(shù)量及炎性細胞浸潤明顯降低、病變程度減輕。對比發(fā)現(xiàn)TFP高劑量組療效明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細胞索排列大致呈放射狀，肝細胞壞死數(shù)量和空泡數(shù)量明顯減少(見圖1)。

圖1 HE染色觀察TFP對急性肝損傷大鼠肝組織病理狀況的影響(HE，×100)Fig.1 Effects of TFP on the hepatic histopathology in acute liver injury rats(HE，×100)注：A.正常組；B.CCl4模型組；C.CCl4+水飛薊素組120 mg/kg；D.CCl4+TFP高劑量組200 mg/kg；E.CCl4+TFP中劑量組100 mg/kg；F.CCl4+TFP低劑量組50 mg/kg，下同。Note:A:Normal group;B:CCl4 model group;C:CCl4+silymarin group;D:CCl4+TFP high dose group;E:CCl4+TFP middle dose group;F:CCl4+TFP low dose group,the same below.

免疫組化結(jié)果如圖2和表5所示，與正常組相比，模型組p-NF-κB p65表達顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，除TFP低劑量組無統(tǒng)計學意義外，其余各給藥組p-NF-κB p65的表達顯著下降(P<0.01)。

3.6 TFP對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織中的SIRT6、p-NF-κB p65、MCP-1、VCAM-1蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中SIRT6蛋白表達水平顯著降低，p-NF-κB p65、MCP-1、VCAM-1蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，TFP高、中劑量組大鼠肝組織中SIRT6蛋白表達水平升高(P<0.01或P<0.05)，p-NF-κB p65、MCP-1、VCAM-1蛋白表達水平降低(P<0.01或P<0.05)，結(jié)果見圖6。

圖2 TFP對急性肝損傷大鼠肝組織中p-NF-κB p65表達的影響(IHC，×200)Fig.2 Effects of TFP on p-NF-κB p65 expression in acute liver injury rats liver tissues (IHC,×200)

表5 TFP對急性肝損傷大鼠肝組織中p-NF-κB p65表達的影響Table 5 Effects of TFP on p-NF-κB p65 expression in acute liver injury rats liver tissues

圖3 TFP對大鼠模型肝組織中SIRT6、p-NF-κB p65、MCP-1、VCAM-1蛋白表達情況的影響Fig.3 Effect of TFP on the SIRT6,p-NF-κB p65,MCP-1 and VCAM-1 protein

4 討論

本實驗通過建立CCl4急性肝損傷大鼠模型，并采用杠板歸總黃酮(TFP)干預(yù)，從肝功能指標、病理切片以及相關(guān)炎癥因子的表達等表達方面，發(fā)現(xiàn)了TFP對大鼠急性肝損傷的緩解作用。在研究中，建立成功的肝損傷動物模型是篩選保肝藥物的關(guān)鍵步驟之一，CCl4主要通過其引起自由基代謝導致氧化應(yīng)激破壞肝組織細胞膜結(jié)構(gòu)，使細胞膜通透性增高，導致中性粒細胞炎性浸潤，細胞質(zhì)中的(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)升高，脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)大量產(chǎn)生持續(xù)破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，造成惡性循環(huán)[13]。除此之外，CCl4還可造成抗氧化物酶總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性下降，引起酶抗氧化系統(tǒng)失衡，可能形成氧化應(yīng)激惡性循環(huán)加重炎癥反應(yīng)[14]。因此，相關(guān)指標ALT、AST、ALP、TBIL、γ-GT、MDA含量升高T-SOD、GSH-Px活性降低可以被認為是判斷急性肝損傷嚴重程度的重要依據(jù)。本實驗中，經(jīng)CCl4造模處理后，與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL、γ-GT、MDA顯著升高，T-SOD、GSH-Px活性顯著降低。觀察病理切片，HE染色顯示肝組織結(jié)構(gòu)嚴重受損，肝細胞有嚴重的空泡變形并被大量的炎癥細胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)受損嚴重，表明急性肝損傷模型建立成功。

據(jù)報道，SIRT6調(diào)節(jié)NF-κB信號傳導通路中的端粒染色質(zhì)和下游基因的表達，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通過調(diào)控與增殖、凋亡、分化、炎癥和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，在環(huán)境刺激應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。在非應(yīng)激條件下，NF-κB被其抑制子IκBα隔離在細胞質(zhì)中，在應(yīng)激條件下，IκBα被降解，允許NF-κB轉(zhuǎn)錄因子移位到細胞核，進而激活關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄[16]。鑒于這些靶基因的重要性及其組織特異性，NF-κB途徑的激活受到幾種機制的嚴格調(diào)控，其中一個涉及依賴于NAD+的脫乙酰化酶和ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶SIRT6[17]。通路被激活后，SIRT6與NF-κB靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，通過去乙?；M蛋白H3的乙?；嚢彼?促進基因沉默[18]。由單核巨噬細胞分泌的TNF-α具有促進炎癥反應(yīng)和活化巨噬細胞的作用，控制著炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和分泌[19]。IL-1β主要由單核巨噬細胞和淋巴細胞分泌，自身除了能夠引發(fā)致病的炎癥反應(yīng)，對多種炎癥因子的表達也有促進作用，參與急性期炎癥反應(yīng)[20]。IL-6是由單核巨噬細胞分泌的具有多種生物學活性的炎癥因子，肝臟受損時，單核巨噬細胞釋放過量的IL-6，進而導致肝細胞大量壞死，長期可發(fā)展為肝纖維化甚至肝硬化[21]。同時，大量 IL-6集聚會加快白細胞通過VCAM-1與內(nèi)皮細胞進行接觸，并且更多的單核細胞通過MCP-1到達肝臟受損部位，加重炎癥反應(yīng)[22]。

現(xiàn)代研究表明，杠板歸具有止咳祛痰、抗氧化抗炎、抗病毒等豐富的藥理作用本實驗結(jié)果顯示，在臨床中也常用來治療燒傷、咳嗽、帶狀皰疹、急性腎炎和細菌性痢疾等多種疾病，均有良好的療效，與此同時杠板歸也被開發(fā)為多種劑型在臨床中普遍使用[23]。本實驗檢測臨床中常用來判斷肝功能的各項指標，結(jié)果顯示經(jīng)過TFP給藥后，與正常組相比，TFP對照組大鼠血清中的主要轉(zhuǎn)氨酶和肝功能指標的影響無統(tǒng)計學意義，這提示TFP不會對肝功能造成不良影響；而與模型組相比，CCl4+TFP各劑量組大鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶含量降低，抗氧化因子升高，提示TFP可有效改善肝功能指標并提高機體抗氧化能力，有望將其開發(fā)為高效、低毒的保肝制劑。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過治療后，大鼠肝組織結(jié)構(gòu)、空泡大小及變形程度較模型組有明顯改善，炎性細胞浸潤明顯減輕，p-NF-κB p65的表達減弱。Western blot檢測SIRT6、p-NF-κB p65、MCP-1、VCAM-1蛋白的表達，其結(jié)果顯示TFP各劑量組SIRT6的表達升高，p-NF-κB p65表達降低，關(guān)鍵促炎因子MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6和IL-1β相的表達減輕，提示TFP可能通過降低肝臟炎癥反應(yīng)和增強抗氧化能力，有效改善大鼠的急性肝損傷。此結(jié)果表明TFP可能通過促進SIRT6表達，和抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄降低下游炎癥因子的釋放發(fā)揮抗急性肝損傷作用。

綜上，TFP可有效減緩肝損傷，其機制可能與SIRT6/NF-κB通路介導的炎癥反應(yīng)和抗氧化有關(guān)。本文研究結(jié)果或為臨床采用TFP減輕肝損傷提供新方法新策略。