臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對CTX導(dǎo)致的藥物性肝損傷大鼠的治療作用

王佳

【摘要】 目的 分析臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSC）對環(huán)磷酰胺（CTX）導(dǎo)致的藥物性肝損傷大鼠的治療作用。方法 以87只健康成年SPF級雄性SD大鼠為研究對象， 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分成溶劑對照組、CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 各29只。CTX聯(lián)合UC-MSC治療組第1、4、7及10天均予以UC-MSC進(jìn)行尾靜脈注射， 第3天給予CTX腹腔注射;CTX給藥組第3天施以CTX腹腔注射;溶劑對照組按照以上兩組同樣時(shí)間、同樣方式給予生理鹽水。對比三組體重、肝臟/體質(zhì)量、血清肝功能生化指標(biāo)[天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、血清總膽紅素（TBIL）、血清堿性磷酸酶（ALP）]、氧化應(yīng)激[超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、過氧化脂質(zhì)（LPO）]損傷狀況。結(jié)果 CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組體重分別為（234.52±15.18）、（253.41±15.36）g低于溶劑對照組的（286.75±20.79）g， 且CTX給藥組體重低于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組;CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組肝臟/體質(zhì)量分別為（0.05±0.01）、（0.04±0.01）高于對照組的（0.03±0.01）， 且CTX給藥組高于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組AST、ALT、TBIL、ALP水平分別為（180.46±20.78）U/L、（102.43±23.49）U/L、（2.31±0.38）μmol/L、（167.46±20.78）U/L及（162.35±20.46）U/L、（82.67±20.16）U/L、（0.87±0.02）μmol/L、（158.15±20.57）U/L均高于溶劑對照組的（98.76±12.49）U/L、（36.85±4.57）U/L、（0.14±0.01）μmol/L、（105.82±25.13）U/L， 且CTX給藥組高于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組SOD、GSH-Px、GSH低于溶劑對照組， 且CTX給藥組低于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05） ;CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組NO、MDA、LPO高于溶劑對照組， 且CTX給藥組高于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 UC-MSC能有效減輕CTX所致的大鼠藥物性肝損傷， 值得臨床應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 環(huán)磷酰胺;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;藥物性肝損傷

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.30.002

The therapeutic effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on CTX-induced liver injury in rats? ?WANG Jia. Jiangsu Zhengda Fenghai Pharmaceutical Co.， Ltd， Nanjing 210046， China

【Abstract】 Objective? ?To analyze the role of umbilical cord mesenchymal stem cells （UC-MSC） on cyclophosphamide （CTX）-induced liver injury in rats. Methods? ?A total of 87 healthy adult SPF male SD rats as study subjects were divided into solvent control group， CTX group， and CTX combined with UC-MSC group according to random numerical table， with 29 rats in each group. In CTX combined with UC-MSC group， UC-MSC was injected via caudal vein on 1st， 4th， 7th and 10th day， and CTX was intraperitoneally injected on 3rd day; CTX group was given intraperitoneal injection of CTX on 3rd day; the solvent control group was given normal saline at the same time and in the same manner. The body weight， liver/body mass， serum liver function biochemical indicators [aspartate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT）， serum total bilirubin （TBIL）， serum alkaline phosphatase （ALP）]， oxidative response kinase [superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， glutathione （GSH）， nitric oxide （NO）， malondioxide aldehyde （MDA）， lipid peroxide （LPO）] of the three groups were compared. Results? ?The weight of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were （234.52±15.18） and （253.41±15.36） g were lower than （286.75±20.79） g of the solvent control group， CTX group was lower than CTX combined with UC-MSC group; the liver/body mass of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were （0.05±0.01） and （0.04±0.01）， which were higher than （0.03±0.01） of the solvent control group， and CTX group was higher than CTX combined with UC-MSC group. The difference was statistically significant （P<0.05）. The levels of AST， ALT， TBIL and ALP of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were （180.46±20.78） U/L， （102.43±23.49） U/L， （2.31±0.38） μmol/L， （167.46±20.78） U/L and （162.35±20.46） U/L， （82.67±20.16） U/L， （0.87±0.02） μmol/L， （158.15±20.57） U/L， which were higher than （98.76±12.49） U/L， （36.85±4.57） U/L， （0.14±0.01） μmol/L， （105.82±25.13） U/L of solvent control group， and CTX group was higher than CTX combined with UC-MSC group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. SOD， GSH-Px and GSH of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were lower than those of solvent control group， and CTX group was lower than CTX combined with UC-MSC group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. NO， MDA， LPO of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were higher than those of solvent control group， and CTX group was higher than CTX combined with UC-MSC group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? ?UC-MSC can effectively reduce the drug-induced liver injury in rats caused by CTX and is worthy of clinical application.

【Key words】 Cyclophosphamide; Umbilical cord mesenchymal stem cells; Drug-induced liver injury

CTX屬于廣譜抗腫瘤藥物， 在多種惡性腫瘤中均可發(fā)揮良好作用[1]。但在CTX使用過程中， 可出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)， 特別是肝毒性， 造成其應(yīng)用范圍受到一定影響[2]。CTX代謝在肝臟內(nèi)進(jìn)行， 通過肝臟微粒體混合功能氧化酶系的作用， 分解為4-羧基環(huán)磷酸胺， 在31-51-核酸內(nèi)切酶作用下轉(zhuǎn)化為丙烯醛與磷酰胺氮芥， 前者為引發(fā)不良反應(yīng)的重要成分， 后者則為抗腫瘤活性成分[3]。丙烯醛屬活動(dòng)性不飽和醛， 能誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)， 造成細(xì)胞損傷。現(xiàn)階段， 臨床上主要利用保肝藥治療CTX所致藥物性肝損傷， 該種療法雖能在一定程度上緩解患者肝功能損傷， 但不可改善其預(yù)后[4]?，F(xiàn)有研究表示[5-7]， UC-MSC在失代償期與終末期肝硬化、酒精性肝損傷治療中均可發(fā)揮積極作用。鑒于此， 為明確在CTX所致藥物性肝損傷治療中UC-MSC的作用， 現(xiàn)對87只健康成年SPF級雄性SD大鼠展開研討， 具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 CTX（通化茂祥制藥有限公司）、蘇木染色液（廈門邁威生物科技有限公司）、戊巴比妥鈉（山西云鵬制藥有限公司）、檸檬酸緩沖液（北京百奧萊博科技有限公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆?、谷胱甘肽過氧化物（海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）、TRIZOL試劑（北京華夏遠(yuǎn)洋生物科技中心）、總超氧物歧化酶（深圳思美泉生物醫(yī)藥要有限公司）、一氧化氮（常州凌肯自動(dòng)化科技有限公司）、脂質(zhì)過氧化物（上海亨代勞商貿(mào)有限公司）、丙二醇（山東富商化工有限公司）。87只健康成年SPF級雄性SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司）， 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為溶劑對照組、CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 各29只。

1. 2 方法

1. 2. 1 分組處理 在SPF級條件下飼養(yǎng)SD大鼠， 合理調(diào)整濕度、溫度， 予以充足食物與水。待大鼠熟悉環(huán)境1周后開展實(shí)驗(yàn)。以下實(shí)驗(yàn)流程均重復(fù)3次：CTX聯(lián)合UC-MSC治療組大鼠首次注射UC-MSC作為實(shí)驗(yàn)第1天， 在第1、4、7及10天分別予以0.4 ml濃度為5×106/ml的UC-MSC實(shí)施尾靜脈注射， 第3天給予200 mg/kg CTX進(jìn)行腹腔注射;CTX組第3天給予CTX， 方法與CTX聯(lián)合UC-MSC治療組一致;溶劑對照組和以上兩組相同時(shí)間、相同方式進(jìn)行生理鹽水注射。實(shí)驗(yàn)期間， 密切觀察大鼠毛色、飲食、體重變化等， 分別于第4、7、10及13天從以上三組中選取7只大鼠， 腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉， 收集心臟血， 將肝臟取出， 測量其濕重， 計(jì)算器官與體重之比， 將部分肝臟組織浸泡于4%多聚甲醛內(nèi)實(shí)施固定， 其余組織用液氮速凍后放于-80℃條件下備用。

1. 2. 2 UC-MSC分離-培養(yǎng)-鑒定 在無菌條件下提取臍血， 以密度梯度法分離獲取單個(gè)核細(xì)胞， 按照5×106/cm2在T25培養(yǎng)瓶中實(shí)施接種， 每瓶內(nèi)加入

10 ml含有10% 血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基液， 并于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。5 d后進(jìn)行換液， 后期每隔3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞融合>80%時(shí)， 以0.05%胰酶消化并進(jìn)行傳代。選擇第3代細(xì)胞， 用小鼠單克隆抗體CD105-FITC、CD34-PE標(biāo)記細(xì)胞， 并用流式細(xì)胞儀實(shí)施檢測。

1. 2. 3 CTX損傷判斷及UC-MSC治療效果驗(yàn)證 ①氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)測定：于預(yù)冷生理鹽水內(nèi)漂洗肝臟組織， 以濾紙擦拭， 取0.1 g放于EP管內(nèi)， 加入0.9 ml

生理鹽水， 以超聲波破碎細(xì)胞法將其制成10%組織勻漿， 頻率控制為10 s/次， 間隔時(shí)間控制為10 s， 反復(fù)

5次。離心后， 提取上層清液， 根據(jù)試劑盒說明書采用硝酸還原酶法、分光光度法測定漿液內(nèi)GSH、SOD、GSH-Px、LPO含量。②外周血肝臟生化指標(biāo)檢測：將心臟血以3500 r/min的速度離心20 min， 收集上層清液， 以全自動(dòng)生化分析儀測定TBIL、ALP、AST、ALT。

1. 3 觀察指標(biāo) 對比三組體重、肝臟/體質(zhì)量、血清肝功能生化指標(biāo)（AST、ALT、TBIL、ALP）、氧化應(yīng)激（SOD、GSH-Px、GSH、NO、MDA、LPO）損傷狀況。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以Graphpad Prism 6作為數(shù)據(jù)制圖工具， 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用F檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 三組體重、肝臟/體質(zhì)量對比 CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組體重分別為（234.52±15.18）、（253.41±15.36）g低于溶劑對照組的（286.75±20.79）g，

且CTX給藥組體重低于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組;CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組肝臟/體質(zhì)量分別為（0.05±0.01）、（0.04±0.01）高于對照組的（0.03±

0.01）， 且CTX給藥組高于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 三組血清肝功能生化指標(biāo)對比 CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組AST、ALT、TBIL、ALP水平分別為（180.46±20.78）U/L、（102.43±23.49）U/L、（2.31±0.38）μmol/L、（167.46±20.78）U/L及（162.35±20.46）U/L、（82.67±20.16）U/L、（0.87±0.02）μmol/L、（158.15±20.57）U/L均高于溶劑對照組的（98.76±12.49）U/L、（36.85±4.57）U/L、（0.14±0.01）μmol/L、（105.82±

25.13）U/L， 且CTX給藥組高于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2. 3 三組氧化應(yīng)激酶損傷狀況對比 CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組SOD、GSH-Px、GSH低于溶劑對照組， 且CTX給藥組低于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05） ;CTX給藥組、CTX聯(lián)合UC-MSC治療組NO、MDA、LPO高于溶劑對照組， 且CTX給藥組高于CTX聯(lián)合UC-MSC治療組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）在體外與體內(nèi)環(huán)境中均具有分泌充足營養(yǎng)因子的能力， 包括肝細(xì)胞生長因子（HGF）、表皮生長因子、堿性成纖細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等[8]。當(dāng)外源性UC-MSC注入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)， 可誘發(fā)損傷部位VEGF水平的增加， 其作用機(jī)理可能為MSC通過促使肝臟微環(huán)境的改變， 來協(xié)助局部肝臟前體細(xì)胞分化、增殖， 從而改善損傷組織灌注與微循環(huán)， 為損傷組織提供充足營養(yǎng)物質(zhì)， 避免實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡;而良好的血供可幫助周邊內(nèi)皮細(xì)胞增殖， 促進(jìn)營養(yǎng)因子分泌， 提高損傷組織修復(fù)速度[9]。體外研究顯示[10]， MSC能下調(diào)白介素-6、腫瘤壞死因子、白介素-1β等促炎因子的表達(dá)， 分泌白介素-10、白介素-12等抑炎因子， 組建免疫耐受環(huán)境， 促使淋巴細(xì)胞凋亡。所以， 當(dāng)MCS進(jìn)入損傷組織后， 通過營養(yǎng)因子的分泌， 能有效改善微環(huán)境， 協(xié)助組織再生， 減輕炎癥反應(yīng)， 防控實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡與組織纖維化， 促使心血管產(chǎn)生。諸多研究均證實(shí)[11， 12]， MSC能有效減輕多種原因所致的肝損傷。

綜合現(xiàn)有研究結(jié)論， 可將MSC移植干預(yù)受損肝臟的途徑歸納為以下幾點(diǎn)：①防控肝臟纖維化：阻止HSC增殖， 引導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解， 促使HSC凋亡。

②協(xié)助內(nèi)源性細(xì)胞增殖及分化：協(xié)助肝細(xì)胞分化、增殖， 防控肝細(xì)胞凋亡， 改善內(nèi)源性異常狀況。③免疫調(diào)節(jié)：激活T細(xì)胞， 阻礙抗原提呈細(xì)胞增殖， 減少刺激T調(diào)節(jié)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的增殖。④轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)質(zhì)細(xì)胞：MSC于體外可轉(zhuǎn)變?yōu)楦螌?shí)質(zhì)細(xì)胞， 且具有肝細(xì)胞的儲(chǔ)備、合成、代謝功能。經(jīng)以上途徑作用下， 可有效緩解小鼠肝功能損傷， 促進(jìn)其肝功能的修復(fù)。在本研究中， CTX給藥組體重、肝臟/體質(zhì)量、血清肝功能指標(biāo)、氧化應(yīng)激酶損傷均出現(xiàn)顯著變化， 而CTX聯(lián)合UC-MSC治療組也出現(xiàn)同樣變化， 但相較于CTX給藥組， CTX聯(lián)合UC-MSC治療組變化幅度較低， 這說明UC-MSC能有效改善CTX造成的小鼠肝功能損傷狀況。

綜上所述， 在CTX所致藥物性肝功能損傷治療中， UC-MSC可發(fā)揮良好作用， 值得臨床實(shí)踐及應(yīng)用。

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[收稿日期：2020-05-13]