microRNA-199a-5p對口腔鱗狀細胞癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的影響機制*

盧靜， 李杰， 張瑩， 吳棟材

(1.北京市朝陽區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 口腔科, 北京 100020； 2.北京大學第一醫(yī)院 口腔科, 北京 100034)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是全球第六大最常見的惡性腫瘤[1-2]，美國每年報告有超過30萬例新病例[3]。盡管OSCC治療(包括手術(shù)、化學或放射治療)已取得進展，但由于局部復發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，OSCC的5年生存率仍低于60%[4]。因此，迫切需要研發(fā)治療OSCC的潛在分子靶標。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)/激酶β(IKKβ)的抑制劑是IKK復合物的關(guān)鍵催化亞基，對激活NF-κB至關(guān)重要[5-6]。IKKβ可通過IKK介導的磷酸化誘導的IκB抑制劑降解來激活NF-κB二聚體，從而使NF-κB二聚體進入細胞核并激活特定的靶基因表達[7]。在OSCC中，NF-κB的激活誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，NF-κB的高表達與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[8-9]。抑制IKKβ可降低SCC-25細胞的細胞侵襲性，可能對OSCC治療有用[10]。MicroRNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上負調(diào)控基因的表達[11,-13]。miR-22通過靶向包含3′NLR家族吡啶結(jié)構(gòu)域抑制OSCC中的細胞增殖、遷移和侵襲[14]。miR-199a-5p通過靶向IKKβ/NF-κB信號通路抑制OSCC細胞中的細胞侵襲和遷移，表明miR-140-5p在OSCC的臨床診斷和治療中可能具有潛在價值。本研究即探究MicroRNA-199a-5p對口腔鱗狀細胞癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的影響機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1細胞 SCC-25、CAL-27、TCA-8113、SCC-4 OSCC和293細胞系獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2分組 將離體培養(yǎng)的SCC-25、CAL-27、TCA-8113、SCC-4 OSCC和293口腔鱗狀細胞癌細胞分為空白對照組(n=24)、NC模擬組(n=24)和miR-199a-5p模擬物組(n=24)。

1.2 方法

1.2.1逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 根據(jù)說明書制備miRNA，NanoDrop 2000分光光度計確定總RNA的濃度和質(zhì)量。使用PrimeScript RT試劑盒合成cDNA進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，TRIzol試劑分離總RNA，用SuperScript III第一鏈合成系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄，在ABI PRISM 7300序列檢測系統(tǒng)上進行miRNA和mRNA的qPCR分析。20 μL PCR包括2 μL cdNA和10 μL 2X qPCR混合物、250 nmoL/L濃度的正向引物(1 μL)、反向引物(1 μL)和6 μL ddH2O，將反應(yīng)混合物在95 ℃變性30 s，進行40個循環(huán)，分別是95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s。用于RT-qPCR分析的引物，見表1。細胞中的miR-199a-5p和核因子κB激酶抑制劑(IKKβ)的表達分別標準化為U6和GAPDH的表達。

表1 RT-qPCR分析引物序列Tab.1 RT-qPCR analysis of primer sequences

1.2.2細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 SCC-25、CAL-27、TCA-8113、SCC-4 OSCC和293細胞在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中添加了10%胎牛血清(含100 m mol青霉素和100 ng/L鏈霉素)，在37 ℃和5%CO2的氣氛中。正?？谇火つぜ毎涤米鲗φ眨⒕S持在口腔角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基中，補充1%角質(zhì)形成細胞生長因子和上皮生長因子混合物置于37 ℃和5%CO2中。miR-199a-5p模擬物，模擬陰性對照(模擬NC組)為miR199a-5p抑制劑和NC抑制劑，購自上?；蛑扑幱邢薰尽iR-199a-5p模擬物，5′-CCC AGU GUU CAG ACU ACC UGU UC-3′；模仿NC，5′-CGG TGU GUU CAG ACU ACC UGU UC-3′。miR-199a-5p抑制劑，5′-AAC AGG TAG TCT GAA CAC T-3′；NC抑制劑，5′-TAA CAC GTC TAT ACG CCC A-3′。為了誘導IKKβ的過表達，通過PCR擴增了IKKβmRNA的編碼結(jié)構(gòu)域序列，將其插入pcDNA 3.0載體以增強其表達，名為pcDNA-IKKβ；空的pcDNA3.1用作陰性對照(NC)。接種TCA-8113和SCC-4細胞(1.0×106/孔)，并在六孔板中過夜生長；第2天時，使用Lipofectamine 2000試劑將細胞與miR-199a-5p模擬物(50 nmoL/L)、miR-199a-5p抑制劑(100 nmoL/L)或NC(100 nmoL/L)，而Oligofectamine轉(zhuǎn)染試劑則按照制造商的規(guī)程使用miR-199a-5p模擬物(50 nmoL/L)+2 μg pcDNA-IKKβ轉(zhuǎn)染48 h。

1.2.3細胞增殖、凋亡和周期分析 將TCA-8113和SCC-4細胞(5×103/孔)接種在96孔板中過夜。轉(zhuǎn)染后24、48和72 h，將CCK-8溶液添加到細胞中，并在37 ℃下再孵育2 h。使用酶標儀在450 nm處測量吸光度，流式細胞儀確定細胞周期分布。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡實驗 根據(jù)核和細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒進行核和細胞質(zhì)蛋白的提取和分離，BCA法測定總細胞蛋白的濃度。蛋白質(zhì)樣品(40 μg/泳道)在8%SDS-PAGE凝膠上進行分析，通過電印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶將膜封閉1 h，與抗IKKβ的一抗孵育[總p65蛋白(Total p65)、核磷酸化(p-)p65、NF-κB(IκB)-α抑制劑、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IκB-α)、組蛋白H3、β-肌動蛋白和α-微管蛋白以及E 盒結(jié)合鋅指蛋白 1(ZEB1)Twist相關(guān)蛋白1(TWIST1)、波形蛋白(Vimentin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]在4 ℃過夜。在室溫下與相應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔或山羊抗大鼠二抗孵育1 h后，使用增強的化學發(fā)光法檢測條帶套件。使用ImageJ軟件分析感興趣譜帶的強度，β-肌動蛋白和α-微管蛋白被用作細胞質(zhì)蛋白的內(nèi)部對照。組蛋白H3蛋白用作核蛋白的內(nèi)部對照，每個實驗重復3次。

1.2.5NF-κB活性測定 將TCA-8113和SCC-4細胞以5×104個細胞/孔的濃度接種在6孔板中，使細胞附著過夜，在每個孔中分別用pGL4.32載體20 ng pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染；6 h后，將細胞用PBS洗滌，用miR-199a-5p模擬物和pcDNA-IKKβ轉(zhuǎn)染24 h，用PBS洗滌細胞，使用熒光素酶測定試劑盒定量熒光素酶活性。

1.2.6Transwell分析 將TCA-8113和SCC-4細胞接種到24孔板中16～18 h，用相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，并繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h。使用帶有Matrigel(用于入侵)或不帶Matrigel的Transwell室插入物進行Transwell遷移和侵襲分析。轉(zhuǎn)染后，將細胞接種到插入片段的上腔中(TCA-8113為6×104細胞，SCC-4為8×104細胞)。200 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，在插入物底部添加600 μL含20%FBS的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基。將TCA-8113細胞培養(yǎng)36 h進行遷移，培養(yǎng)48 h進行侵襲實驗，將SCC-4細胞遷移48 h并侵襲72 h；遷移或侵襲的細胞用結(jié)晶紫染色并用顯微鏡照相。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 miR-199a-5p在人OSCC細胞和細胞系中的表達

與正?？谇簧掀ぜ毎容^，在OSCC細胞中miR-199a-5p表達下調(diào)(P<0.01，圖1A)；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的細胞(n=12)比較，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC細胞(n=28)中miR-199a-5p表達降低(P<0.05)。OSCC細胞SCC-25、cAL-27、TCA-8113和SCC-4中miR-199a-5p下調(diào)(P<0.05，圖1B)。

注：(1)與正常口腔上皮細胞比較，P<0.01；(2)與HOK組比較，P<0.05。圖1 miR-199a-5p在人OSCC細胞和細胞系中的表達Fig.1 Expression of miR-199A-5p in human OSCC cells and cell lines

2.2 miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染細胞對miR-199a-5p表達的影響

RTPCR分析顯示，與TCA-8113和SCC-4細胞的空白對照組比較，用miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染后，miR-199a-5p的表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義。見表2。CCK 8分析表明，與模擬NC轉(zhuǎn)染的細胞比較，miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染抑制了細胞活力(表3)，在TCA-8113和SCC-4細胞中觀察到的凋亡誘導。流式細胞儀分析的結(jié)果表明，miR-199a-5p的過表達通過提高TCA-8113和SCC-4細胞中G0/G1期的細胞百分比而導致G0/G1期停滯。miR-199a-5p通過誘導細胞凋亡和細胞周期停滯而部分降低了生存能力(圖2)。

表2 miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染細胞促進miR-199a-5p的表達上調(diào)(n=24)Tab.2 Expression of miR-199a-5p was significantly up-regulated after transfection with miR-199a-5p mimics(n=24)

表3 miR-199a-5p模擬物轉(zhuǎn)染細胞抑制細胞活力(n=24)Tab.3 miR-199a-5p mimic transfected cells inhibited cell activity(n=24)

注：(1)與NC模擬物組比較，P<0.05。圖2 miR-199a-5p模擬物促進TCA-8113和SCC-4細胞凋亡Fig.2 Apoptosis of TCA-8113 and SCC-4 cells promoted by miR-199a-5p mimics

2.3 miR-199a-5p對IKKβ表達的影響

如圖3所示，在miR-199a-5p過表達后，蛋白水平的IKKβ表達下調(diào)，但在TCA-8113和SCC-4細胞中敲低miR-199a-5p后，IKKβ的表達上調(diào)。

注：(1)與NC模擬物組比較，P<0.05。圖3 miR-199a-5p過表達對TCA-8113和SCC-4細胞中IKKβ表達水平的影響Fig.3 Effect of miR-199a-5p overexpression on IKKβ expression level in TCA-8113 and SCC-4 cells

由于在OSCC腫瘤樣品中miR-199a-5p被下調(diào)，因此IHC在OSCC腫瘤細胞和鄰近細胞中也檢測到IKKβ的表達水平，表明miR-199a-5p可通過靶向IKKβ來發(fā)揮抑癌作用。miR-199a-5p模擬物抑制了pIκB-α的水平，而IKKβ的過表達逆轉(zhuǎn)了miR-199a-5p模擬物在TCA-8113和SCC-4細胞中的這些抑制作用(圖4A、表4和表5)。miR-199a-5p通過下調(diào)IKKβ抑制了NF-κB途徑的激活。miR-199a-5p模擬物在蛋白質(zhì)水平上均抑制了p65表達，p65的過表達抑制了ZEB1、TWIST1、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(圖4B、表6)，減輕miR-199a-5p對OSCC細胞的遷移和侵襲的抑制(圖5、表7)，表明miR-199a-5p誘導的EMT取決于p65的表達。

圖4 miR-199a-5p抑制IKKβ介導的NF-κB途徑活化從而抑制EMTFig.4 Activation of IKKβ-mediated NF-κB pathway inhibited by miR-199a-5p

表4 TCA-8113干預(yù)后pIκB-α、IKKβ和Total p65蛋白水平Tab.4 Comparative analysis of pIκB-α, IKKβ and total p65 after TCA-8113

表5 SCC-4干預(yù)后pIκB-α、IKKβ和Total p65蛋白水平比較Tab.5 Comparative analysis of pIκB-α, IKKβ and Total p65 after SCC-4

表6 TCA-8113干預(yù)后ZEB1、TWIST1、Vimntin、E-cadherin和GAPDH蛋白水平Tab.6 Comparative analysis of ZEB1, TWIST1, Vimntin, E-cadherin and GAPDH levels after TCA-8113 intervention

表7 TCA-8113干預(yù)后ZEB1、TWIST1、Vimntin、E-cadherin和GAPDH蛋白水平Tab.7 Comparative analysis of ZEB1, TWIST1, Vimntin, E-cadherin and GAPDH levels after SCC-4 intervention

注：(1)與空白對照組相比較，P<0.05。圖5 miR-199a-5p抑制TCA-8113和SCC-4細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移(200×)Fig.5 Invasion and metastasis of TCA-8113 and SCC-4 cells inhibited by miR-199a-5p(200×)

3 討論

頭頸部鱗癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移是其預(yù)后較差的主要原因，有早期廣泛淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的傾向。EMT是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。EMT已經(jīng)被證明在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要作用。microRNA是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，是許多生理和病理過程的基因表達的重要調(diào)控者。microRNA可能通過影響細胞表型來調(diào)控EMT過程中的細胞狀態(tài)。miRNA在OSCC中可作為致癌基因或抑癌基因。miR-199a-5p在人類多種類型的癌癥中均被下調(diào)[11-13,19]。miR-199a-5p下調(diào)了其靶基因在不同類型腫瘤中的表達，包括CD44、GSK-3β和結(jié)締細胞生長因子。IKKβ是IKK復合物的催化亞基，是NF-κB信號通路的抑制劑。IKKβ在不同類型的癌中起癌基因的作用。IKKβ通過抑制上皮細胞中線粒體途徑的凋亡來促進腫瘤的發(fā)展[9]。IKKβ促進前列腺癌細胞的增殖和遷移，抑制其凋亡[14]。IKKβ充當某些miRNA的下游分子，以介導miRNA在不同腫瘤類型中的作用，包括miR-429和miR-497。本研究使用在線信息工具可預(yù)測IKKβ是miR-199a-5p的靶標，發(fā)現(xiàn)細胞系和OSCC細胞中的IKKβ水平高于HOK細胞和匹配的相鄰細胞中的IKKβ水平。在腫瘤細胞中miR-199a-5p和IKKβ之間存在負相關(guān)。IKKβ的過表達逆轉(zhuǎn)了miR-199a-5p在OSCC細胞中表達增強引起的抑制作用。這表明miR-199a-5p通過靶向IKKβ發(fā)揮其抗腫瘤作用。

NFK-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子,由一個復雜的體系組成。NF-κB在腫瘤的抗凋亡機制中起著至關(guān)重要的作用。NF-κB的激活在人類幾種類型腫瘤的發(fā)病機理中很重要。在OSCC中，NF-κB具有組成性活性，參與促進OSCC細胞的侵襲，這表明抑制NF-κB的活性可能構(gòu)成治療OSCC侵襲性的有前途的治療方法。miR-92b的上調(diào)會加速腫瘤的生長，這種作用可能與OSCC中NF-κB信號通路的激活有關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p的上調(diào)通過抑制IKKβ降低了關(guān)鍵NF-κB通路蛋白的水平。miR-199a-5p抑制IKKβ以抑制NF-κB活性，因此抑制OSCC細胞的惡性腫瘤。NF-κB與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲密切相關(guān)。NF-κB的激活是腫瘤細胞抵抗TNF介導的細胞凋亡的重要機制,而抑制NF-κB的激活可以導致腫瘤細胞的大量凋亡。通過基因治療來抑制NF-κB的活性,再輔以常規(guī)的化療將有望成為一種治療口腔鱗癌的有效方法。

綜上所述，miR-199a-5p在OSCC細胞和細胞系中下調(diào)。還證明了miR-199a-5p通過抑制IKKβ發(fā)揮腫瘤抑制作用，后者抑制NF-κB途徑的激活，從而抑制口腔鱗狀細胞癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移。這表明，miR-199a-5p可能是預(yù)后預(yù)測和治療策略的潛在靶標。