樂伐替尼與瑞格菲尼對肝癌細(xì)胞PD-L1的作用及機(jī)制*

許靜， 喻超， 楊盛力， 孫誠誼

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550004； 貴州醫(yī)科大學(xué) 肝膽胰脾重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 貴州省肝膽胰脾疾病研究所， 貴州 貴陽 550004)

過去十年來，肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)成為全球癌癥死亡的第三大主要原因，其主要是由乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的慢性感染、酗酒及代謝綜合征(糖尿病和肥胖癥)引起的[1-2]。發(fā)達(dá)國家疾病檢測方案中，約40%～50%的早期肝細(xì)胞癌患者可進(jìn)行潛在的治療[3]，中期肝癌的患者可以接受局部治療，而晚期肝癌的患者可以從全身治療中受益[4]，大約50%的肝癌患者會接受全身治療[5-6]。目前，分子靶向治療在肝癌治療中起著至關(guān)重要的作用[7]。瑞格菲尼是口服的血管生成性血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)及基質(zhì)受體酪氨酸激酶的抑制劑[8]，基于3期隨機(jī)雙盲對照試驗的結(jié)果，該藥已被批準(zhǔn)用作治療肝癌的二線藥物[9-10]。樂伐替尼是一種口服的多靶點酪氨酸激酶抑制劑，可選擇性抑制血管生成性血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子受體及血小板衍生的生長因子受體[11-13]。臨床前期研究表明，樂伐替尼能有效阻斷血管內(nèi)皮生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子驅(qū)動的血管生成，阻斷VEGFR相關(guān)的淋巴管生成[14]，已被用于治療進(jìn)行性、局部復(fù)發(fā)性及放射性碘難治性甲狀腺癌[14]；樂伐替尼聯(lián)合依維莫司以血管內(nèi)皮生長因子為靶點，用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌[15]。最近，在樂伐替尼的肝癌3期臨床試驗中，樂伐替尼通過統(tǒng)計證實治療效果不亞于索拉菲尼，并證明了對總體生存率有明顯的影響[14]，且該藥在肝癌疾病的緩解率，無復(fù)發(fā)生存期方面取得了重大的臨床效果[16]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞免疫檢查點蛋白通常表達(dá)上調(diào)，從而通過抑制T細(xì)胞攻擊來逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷[17]；腫瘤細(xì)胞中的程序性死亡-配體1(programmed cell death -ligand1，PD-L1)與在T細(xì)、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷性T細(xì)胞上表達(dá)的程序性死亡1(programmed cell death protein 1，PD-1)結(jié)合，可以抑制抗癌免疫力[18-19]。因此，抗PD-L1和抗PD-1抗體已用于治療癌癥，但對分子靶向藥對PD-L1表達(dá)的調(diào)控及分子機(jī)制尚不清楚，本研究探討分子靶向藥物瑞格菲尼與樂伐替尼調(diào)控PD-L1的作用及分子機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與實驗動物 人肝癌Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)；4周齡雌性裸鼠(BALB/c)小鼠30只，體質(zhì)量(16±5)g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.1.2藥物、主要試劑與儀器 樂伐替尼粉劑(批號S1164，2 mg/支)和瑞格菲尼粉劑(批號S1178，5 mg/支)購自美國Selleck公司，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF1α)、髓細(xì)胞增生原癌基因(myelocytomatosis oncogene，MYC)、缺氧誘導(dǎo)因子-2α(hypoxia inducible factor-2α,HIF2α)，信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)、黏蛋白1-C(mucin 1-C，MUC1-C)、細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK14)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)引物購自武漢谷歌生物科技有限公司，二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自美國MP Biomedical公司，胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、Lipofectamine 3000、Opti-MEM培養(yǎng)基、siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒及提取RNA所用的Trizol均購自美國Invitrogen公司，TGF-β1的空載質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒和Western blot試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司，TGF-β1、PD-L1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Cellstar公司。

1.2 方法

1.2.1TGF-β1干擾RNA的轉(zhuǎn)染 無酶水稀釋TGF-β1干擾RNA干粉后，調(diào)節(jié)濃度至20 mmol/L。取長滿50%～60%培養(yǎng)瓶的肝癌Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，2種細(xì)胞各分為對照組和干擾組。2種細(xì)胞的干擾組進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，取2支1.5 mL EP管，再分別取si-TGF-β1 5 μL、Opti-MEM 125 μL、lipofectamine3000 5 μL及Opti-MEM 125 μL混合均勻并靜置5 min，2支EP管的液體輕輕混合均勻、靜置20 min；混合液加入培養(yǎng)瓶中，與換好的培養(yǎng)液搖晃混勻；2種細(xì)胞的對照組按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將培養(yǎng)瓶置于37 ℃的恒溫加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換液。

1.2.2皮下成瘤實驗及分組 取人肝癌Hep3B細(xì)胞(1×106個)皮下接種于所有小鼠右側(cè)腹肋下，觀察裸鼠皮下成瘤情況；1周后將皮下成瘤的30只小鼠隨機(jī)分為對照組[DMSO 20 μg/(kg·d)]、樂伐替尼組[注射樂伐替尼4 μg/(kg·d)]及瑞格菲尼組[注射瑞格菲尼20 mg/(kg·d)]，10只/組，每2 d對各組小鼠進(jìn)行皮周注射，持續(xù)3周；末次給藥后24 h處死小鼠，取腫瘤塊，待后續(xù)實驗使用。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測 取人肝癌Hep3B、SMMC-7721細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染TGF-β1的空載體、干擾質(zhì)粒后置于含5%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；使用Trizol試劑分別從上述細(xì)胞中提取總RNA，用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR試驗，檢測肝癌細(xì)胞中HIF1α、MYC、HIF2α、STAT3、MUC1-C、CDK5、MAPK14、EGFR、ALK及TGF-β1的mRNA表達(dá)水平，所有測定均重復(fù)3次。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2.4Western blot實驗 分別取各組小鼠的皮下瘤組織及1.2.2項下各組肝癌細(xì)胞加入RIPA緩沖液，置于冰上裂解40 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液于5×SDS-PAGE上樣緩沖液中煮沸10 min，10%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉1 h，4 ℃與抗PD-L1(1 ∶3 000)、抗TGF-β1(1 ∶500)和抗GAPDH(1 ∶3 000)的抗體孵育過夜；次日與PD-L1和TGF-β1的二抗于室溫孵育2 h，TBST溶液洗脫3次，增強化學(xué)發(fā)光(Electro Chemi Luminescence，ECL)檢測，使用ImageJ圖像分析軟件分析PD-L1和TGF-β1的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藥物對PD-L1各上游基因的調(diào)控作用

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，樂伐替尼組和瑞格菲尼組小鼠皮下肝癌移植瘤組織中HIF1α、MYC、HIF2α及MUC1-CmRNA表達(dá)均上調(diào)，STAT3、CDK5、MAPK14、EGFR及ALKmRNA表達(dá)均下調(diào)，但樂伐替尼組TGF-β1 mRNA表達(dá)增加，瑞格菲尼組TGF-β1 mRNA表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖1 各組小鼠皮下肝癌移植瘤組織中PD-L1各上游基因的表達(dá)(qRT-PCR)Fig.1 The expression levels of the upstream gene of PD-L1 in the xenograft tumors tissues of each group(qRT-PCR)

2.2 藥物對PD-L1和TGF-β1的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，樂伐替尼組肝癌Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞的TGF-β1 mRNA表達(dá)水平均上升，瑞格菲尼組的TGF-β1 mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05，圖2A)； Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，樂伐替尼組肝癌Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞的PD-L1和TGF-β1蛋白表達(dá)量均上升，瑞格菲尼組PD-L1和TGF-β1蛋白表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2B和2C)。

注：A為qRT-PCR檢測結(jié)果，B、C為Western blot檢測結(jié)果；(1)與對照組相比，P<0.05。圖2 樂伐替尼組和瑞格菲尼組不同肝癌細(xì)胞中TGF-β1和PD-L1的表達(dá)Fig.2 Expression of TGF-β1和PD-L1 in hepatocellular carcinoma cells in lenvatinib group and regorafenib group

2.3 干擾RNA轉(zhuǎn)染效果的驗證

轉(zhuǎn)染siRNA后qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，肝癌Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞干擾組TGF-β1 mRNA表達(dá)量分別較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3A)；Western blot檢測結(jié)果顯示，肝癌Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞干擾組的TGF-β1蛋白表達(dá)量分別較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3B和3C)。

注：A為qRT-PCR檢測結(jié)果，B、C為Western blot檢測結(jié)果；(1)與對照組比較，P<0.05。圖3 對照組和干擾組TGF-β1的表達(dá)Fig.3 Expression of TGF-β1 in the control and interfering group

2.4 干擾TGF-β1表達(dá)后對肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，肝癌Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞干擾組的PD-L1 mRNA表達(dá)量分別較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4A)；Western blot 結(jié)果顯示，肝癌Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞干擾組的TGF-β1和PD-L1蛋白表達(dá)量分別較對照組下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4B和4C)。

注：A為qRT-PCR檢測結(jié)果，B、C為Western blot檢測結(jié)果；(1)與對照組相比，P<0.05。圖4 抑制TGF-β1后肝癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)Fig.4 Expression of PD-L1 after inhibited the expression of TGF-β1

3 討論

瑞格菲尼和樂伐替尼具有多個靶點，并在腫瘤治療中廣泛使用，且兩者均已獲得FDA批準(zhǔn)，可用于治療肝細(xì)胞癌[20]。然而，以分子靶向的腫瘤很少能完全抑制腫瘤，藥物的治療作用往往是暫時的，因此，大多數(shù)患者最終會產(chǎn)生耐藥性并復(fù)發(fā)[21]。因此，迫切需要更有效的治療策略和藥物，來改善表現(xiàn)出抗藥性的肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后。PD-L1是PD1的配體，在許多類型的腫瘤細(xì)胞(包括黑素瘤，卵巢癌和肺癌)中均表達(dá)上調(diào)[22-23]。由于PD1和PD-L1的阻斷在抑制腫瘤上已產(chǎn)生了可喜的臨床效果，因此，了解兩種分子靶向治療藥物影響PD-L1的調(diào)節(jié)機(jī)制可能有助于尋找有效的臨床治療策略。本研究先構(gòu)建了裸鼠的皮下肝癌成瘤模型，根據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)，本實驗常規(guī)使用雌性裸鼠[24]；同時通過閱讀文獻(xiàn)，篩選出與PD-L1相關(guān)度較高的調(diào)控基因HIF1α、MYC、HIF2α、STAT3、MUC1-C、CDK5、MAPK14、EGFR、ALK及TGF-β1，先進(jìn)行qRT-PCR實驗，結(jié)果顯示樂伐替尼和瑞格菲尼對TGF-β1具有反向調(diào)節(jié)作用，這與2種靶向藥對PD-L1的調(diào)節(jié)方式一致。本研究中qRT-PCR對裸鼠植皮下肝癌移植瘤中PD-L1的上游調(diào)控基因進(jìn)行檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樂伐替尼和瑞格菲尼對TGF-β1表達(dá)出現(xiàn)了差異性調(diào)節(jié)，即樂伐替尼使TGF-β1表達(dá)增加，瑞格菲尼組使TGF-β1表達(dá)降低，再通過qRT-PCR和Western blot在細(xì)胞水平上驗證樂伐替尼和瑞格菲尼對TGF-β1表達(dá)的調(diào)控，結(jié)果與肝癌組織一致。因此推測樂伐替尼和瑞格菲尼可能通過TGF-β1調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而在肝癌中產(chǎn)生不完全相同的治療效果。

TGF-β1是一種多功能的多肽細(xì)胞因子，在炎癥中起作用，由巨噬細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生[25]。在缺氧和炎性條件下，TGF-β1通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程(例如細(xì)胞增殖，分化，遷移和凋亡)從而在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用[26-28]。最近的證據(jù)表明，TGF-β1是癌前細(xì)胞中的主要腫瘤抑制因子，但在癌癥進(jìn)展晚期，TGF-β1可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)并導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移增加[29]。由于TGF-β1在轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用，已開發(fā)出靶向TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑來治療癌癥[30]。但是，TGF-β1與免疫檢查點之間的關(guān)系尚不清楚。雖然樂伐替尼和瑞格菲尼對瘤體中的TGF-β1具有反向調(diào)節(jié)作用，但腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，因此進(jìn)一步在肝癌SMMC-7721和Hep3B細(xì)胞中用qRT-PCR法和Western blot分別從分子和蛋白水平檢測樂伐替尼和瑞格菲尼對肝癌細(xì)胞TGF-β1 表達(dá)量的影響，結(jié)果提示樂伐替尼和瑞格菲尼導(dǎo)致肝癌細(xì)胞TGF-β1的相反調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)染siRNA干擾TGF-β1的表達(dá)，用qRT-PCR從分子水平確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功，肝癌細(xì)胞中TGF-β1 mRNA表達(dá)量下降。而TGF-β1被抑制后，PD-L1的表達(dá)下調(diào)：qRT-PCR和Western-blot結(jié)果均提示，轉(zhuǎn)染TGF-β1 shRNA后，PD-L1 mRNA及蛋白表達(dá)量均下降。

綜上所述，本研究確定了瑞格菲尼和樂伐替尼對肝癌細(xì)胞中PD-L1和TGF-β1之間的機(jī)制和功能聯(lián)系。這些結(jié)果為靶向TGF-β1/PD-L1軸建立了潛在的臨床策略，該調(diào)控機(jī)制可能會提高多激酶激酶抑制劑的療效，并成功解決耐藥性問題。