外源性硫化氫對(duì)氟誘導(dǎo)損傷SH-SY5Y細(xì)胞的作用及機(jī)制*

潘際剛， 吳昌學(xué)， 齊曉嵐， 李成， 朱衛(wèi)， 劉宇, 官志忠2,,4**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

研究表明，氟中毒可造成染氟成年及子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，其機(jī)制與氧化應(yīng)激水平增高、膽堿酯酶活性降低有關(guān)[1-6]。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)目前已被公認(rèn)為是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化劑，可直接發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用[7]；并可通過(guò)增加谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，間接降低活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)等氧化應(yīng)激損傷[8-9]，然而H2S在氟中毒神經(jīng)損傷方面的保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察離體SH-SY5Y細(xì)胞在給予外源性H2S后對(duì)氟中毒導(dǎo)致的神經(jīng)損傷發(fā)揮的保護(hù)作用、并研究其抗氧化保護(hù)機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.1.2主要試劑與儀器 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，NaF和NaHS(美國(guó)Sigma公司)，ROS檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，臺(tái)盼藍(lán)(美國(guó)Amresco公司)；321型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，F(xiàn)ACS CantoTMII system型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)，H-7650透射電鏡(日本日立公司)，CKX41奧林巴斯顯微鏡、TX51型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 000U/L，鏈霉素100 000 U/L)的DMEM培養(yǎng)基、5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～70%時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后進(jìn)一步分別加NaF、NaHS孵育48 h分別作為NaF組、NaHS組，NaHS預(yù)處理30 min后加2 mmol/L NaF 48 h作為NaF聯(lián)合NaHS組，不進(jìn)行處理孵育48h作為Control組。

1.2.2臺(tái)盼藍(lán)拒染法 收集各組細(xì)胞，胰酶消化制備單細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9 ∶1混合混勻后染色3min，在倒置顯微鏡100倍下計(jì)數(shù)藍(lán)染及不染色細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%]。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)觀察 各組細(xì)胞生長(zhǎng)約70%～80%后，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，加NaF或NaHS 48 h，在光學(xué)顯微鏡100倍下進(jìn)行觀察；收集Control、NaF和NaF聯(lián)合NaHS組細(xì)胞于離心管37 ℃、1 000 r/min離心5 min，2.5%戊二醛室溫固定2 d，100 mmol/L磷酸緩沖液沖洗，1%鋨酸后固定2 h，丙酮梯度脫水、滲透、包埋、聚合12 h，組織定向包埋、超薄切片、染色，透射電鏡4 000倍下觀察各組細(xì)胞。

1.2.4ROS水平檢測(cè) 收集六孔板各組細(xì)胞用PBS洗2次，加10 μmol/L DCFH-DA(無(wú)血清培養(yǎng)液1 ∶1 000稀釋)37 ℃避光、孵育20 min，培養(yǎng)液洗2次，洗除多余DCFH-DA。用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性效應(yīng)

臺(tái)盼藍(lán)拒染法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control組和NaF聯(lián)合NaHS組SH-SY5Y細(xì)胞的存活率分別高于NaF組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Control組和NaHS組、Control組和NaF聯(lián)合NaHS組組間細(xì)胞存活率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

注：(1)與Control組相比，P<0.05；(2)與NaF組相比，P<0.05。圖1 NaHS和NaF對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of NaHS and NaF on the survival rates of SH-SY5Y cells

2.2 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

光鏡和相差顯微鏡顯示，Control組SH-SY5Y細(xì)胞大小均勻、透亮；NaF組壞死的SH-SY5Y細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞狀態(tài)較差，存活細(xì)胞數(shù)下降；NaF聯(lián)合NaHS組細(xì)胞則細(xì)胞活性及數(shù)量與Control組無(wú)異(圖2)。透射電鏡顯示Control組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好、線粒體豐富、細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻；NaF組SH-SY5Y亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清，大量線粒體灰白色，呈空泡樣變性(圖3)，這些異常形態(tài)和結(jié)構(gòu)的紊亂可被NaHS預(yù)處理所預(yù)防。

注：箭頭顯示不同處理后的細(xì)胞狀態(tài)。圖2 NaHS和NaF對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(200×)Fig.2 Effects of NaHS and NaF on SH-SY5Y cell growth(200×)

Control組 NaF組 NaF聯(lián)合NaHS組注：箭頭表示線粒體。圖3 透射電鏡顯示NaHS和NaF對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(4 000×)Fig.3 Effects of NaHS and NaF on the ultrastructure of SH-SY5Y cells shown by transmission electron microscopy(4 000×)

2.3 ROS水平

NaF組SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平分別高于Control組和NaF聯(lián)合NaHS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；但Control組和NaF聯(lián)合NaHS組SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

注：A、B、C為細(xì)胞ROS熒光圖像，D為ROS水平的定量結(jié)果；(1)與Control組相比，P<0.01；(2)與NaF組相比，P<0.05。圖4 NaHS和NaF對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響Fig.4 Effects of NaHS and NaF on the levels of ROS in SH-SY5Y cells

3 討論

有報(bào)道，CCK-8檢測(cè)30、40和80 mg/L NaF暴露24 h可抑制SH-SY5Y細(xì)胞活力[10]，與本實(shí)驗(yàn)臺(tái)盼藍(lán)染色所測(cè)細(xì)胞活力受到氟抑制結(jié)果相一致，不同之處在于實(shí)驗(yàn)所測(cè)細(xì)胞活力方法不同；另外，本實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞氟的濃度和時(shí)間分別是2 mmol/L和48 h；2 mmol/L相當(dāng)于80 mg/L這一高劑量，時(shí)間更長(zhǎng)相對(duì)損害要大活力下降到一半，而其他實(shí)驗(yàn)室80 mg/L NaF暴露24 h細(xì)胞活力下降至69%[10]。在有些實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用100 mg/L含氟飲用水2個(gè)月制造慢性氟中毒大鼠模型，模擬人類(lèi)地方性氟暴露地區(qū)的情況，尼氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟對(duì)大鼠腦神經(jīng)元形態(tài)及學(xué)習(xí)記憶行為同樣造成損害[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，氟抑制細(xì)胞呼吸和線粒體三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的生成[12]。線粒體不僅作為細(xì)胞能量工廠，還參與氧化還原平衡、鈣儲(chǔ)存和信號(hào)傳遞、調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡，決定細(xì)胞的存活[13]。有報(bào)道，慢性氟中毒動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞密度降低、細(xì)胞膜內(nèi)卷、線粒體腫大、堆積、核固縮、空泡變性、突觸間隙融合或增寬、結(jié)構(gòu)模糊不清[14-16]。本實(shí)驗(yàn)中SH-SY5Y染氟細(xì)胞也出現(xiàn)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清，線粒體空泡變性。

H2S不僅被哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體當(dāng)能量物質(zhì)使用[17]，而且它還可以穩(wěn)定線粒體膜電位，阻止細(xì)胞色素C的釋放、Caspase-9/3的激活和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的裂解來(lái)阻斷魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生[18-19]。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，燃煤型地方性氟中毒患者內(nèi)源性H2S水平顯著下降，大鼠腦組織胱硫脒-β-合成酶(cystathionine β-synthetase，CBS)酶活性受到抑制，CBS蛋白表達(dá)代償性增加[20-21]。這些結(jié)果表明，氟中毒已顯著影響了機(jī)體內(nèi)源性CBS/H2S的水平。由于H2S這種能量物質(zhì)在線粒體中的缺乏可能引起神經(jīng)細(xì)胞線粒體等亞細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的損傷，而補(bǔ)充H2S可拮抗氟誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)、逆轉(zhuǎn)以上形態(tài)和結(jié)構(gòu)的紊亂。

氧化應(yīng)激是氟損傷發(fā)病機(jī)制得到廣泛認(rèn)可的一個(gè)重要機(jī)制[22]。氟中毒可導(dǎo)致線粒體ROS的產(chǎn)生造成大分子的氧化，導(dǎo)致線粒體膜磷脂受到自由基攻擊、DNA碎裂、核染色質(zhì)濃縮和細(xì)胞凋亡[23-24]。本實(shí)驗(yàn)中，NaF暴露48h細(xì)胞活性氧較Control組明顯增加(P<0.01)。

H2S能夠促進(jìn)線粒體生物能量生成和功能，因此可以抵抗細(xì)胞應(yīng)激；不僅能提高線粒體谷胱甘肽水平、清除ROS，還能進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾[7-9, 25]。本實(shí)驗(yàn)NaHS預(yù)處理后可顯著拮抗氟所致ROS水平的增加，表明H2S可以抑制細(xì)胞高氟引起的氧化應(yīng)激水平增加，發(fā)揮一定保護(hù)作用。盡管本實(shí)驗(yàn)初步表明，H2S對(duì)氟損傷的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用涉及抗氧化這一途徑。然而，H2S降低線粒體ROS、改善染氟細(xì)胞形態(tài)和功能的詳細(xì)過(guò)程還有待進(jìn)一步證實(shí)。