亞砷酸鈉誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡及硫化氫的干預(yù)作用*

潘際剛， 吳昌學(xué)， 齊曉嵐， 范海瓊， 李成， 朱衛(wèi)

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

2019年7月23日，砷及砷化合物被列入有毒有害水污染物名錄。貴州省屬于地方性燃煤污染型砷中毒較嚴(yán)重病區(qū)[1]，砷在神經(jīng)系統(tǒng)的累積將引起活性氧的增加從而造成神經(jīng)毒性損害。大腦由于不飽和脂肪酸的存在、解毒酶活性的降低等因素易遭受氧化應(yīng)激損傷[2-3]，本課題組前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)砷引起神經(jīng)細(xì)胞的損害機(jī)制與H2S合成酶-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)移酶(MST)表達(dá)降低有關(guān)[4]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)Hoechst33342/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NaHS對(duì)砷誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡有明顯拮抗效應(yīng)，從而驗(yàn)證外源性H2S的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，NaHS、NaAsO2購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，AnnexinV FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞分為對(duì)照組、NaHS組、NaAsO2(20或40 μmol/L)組及NaHS+NaAsO2(NaHS預(yù)處理30 min)組，于10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中、37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h后，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2染色 取1.2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)獲得的SH-SY5Y細(xì)胞，PBS洗滌1次后取PI染色液5 μL、染色緩沖液1 mL和Hoechst33342液5 μL加入每孔。4 ℃孵育30 min進(jìn)行染色，然后用PBS洗滌1次，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取8個(gè)視野計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)(每組不少于1 000個(gè))，計(jì)算凋亡率。

1.2.3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取1.2項(xiàng)試驗(yàn)獲得的SH-SY5Y細(xì)胞將1-5×106/mL細(xì)胞收集到10 mL的離心管中離心(1 000 r/min)5 min，棄去上清、用孵育緩沖液洗滌1次、等速離心5 min后，用標(biāo)記溶液100 μL重懸細(xì)胞。在室溫下避光孵育10 min、再次離心5 min、緩沖液洗1次后，再加入SA-FLOUS熒光溶液4 ℃孵育20 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，F(xiàn)ITC熒光波長(zhǎng)515 nm，PI熒光波長(zhǎng)大于560 nm。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，上樣、12%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上經(jīng)脫脂奶粉封閉2 h后，加—抗(Cleaved caspase-12、Caspase-12和β-actin，1 ∶1 000)及二抗(1 ∶3 000、ECL顯色曝光檢測(cè)cleaved Caspase-12及Caspase-12蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Hoechst33342/PI雙染對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

熒光顯微鏡檢測(cè)顯示，隨染砷濃度增加，24或48 h后SH-SY5Y 細(xì)胞核熒光染色顯著增加(P<0.05)；NaHS預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)20或40 μmol/L NaAsO2暴露48 h對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞核熒光增強(qiáng)效應(yīng)(P<0.05，圖1)；NaHS預(yù)處理對(duì)24 h同等濃度砷暴露誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響(P>0.05，圖1)。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與40 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖1 Hoechst33342/PI雙染檢測(cè)NaAsO2和NaHS對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的影響(200×)Fig.1 Effect of NaAsO2 and NaHS in SH-SY5Y cell apoptosis by Hoechst33342/PI double staining(200×)

2.2 NaAsO2和NaHS對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，20和40 μmol/L NaAsO2作用24 h或48 h可濃度依賴性增加SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率，分別從(18.93±0.28)%升高到(37.8±1.46)%，從(33.13±0.57)%升高到(53.93±2.46)%(P<0.05，圖2)。NaHS預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)20和40 μmol/L NaAsO2暴露48 h對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響，使NaAsO2誘導(dǎo)的凋亡率分別下降至(29.80±0.10)%和(40.53±2.94)%(P<0.05，圖2)；但對(duì)NaAsO2暴露24 h后增加的細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響。

注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.05, (2)P<0.01；(3)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與40 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NaAsO2和NaHS對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of NaAsO2 and NaHS on cellular apoptosis by flow cytometric

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與NaAsO2 40 μmol/L組比較，P<0.05；A為 NaAsO2暴露24 h, B為NaAsO2暴露48 h。圖3 NaAsO2和NaHS對(duì)cleaved/Caspase-12 expresion的影響(Western blot)Fig.3 Effects of NaAsO2 and NaHS on cleaved/Caspase-12 expression levels (Western blot)

3 討論

研究報(bào)道，H2S在健康和疾病的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮著各種生物調(diào)節(jié)作用[6-10]。H2S通過(guò)增強(qiáng)谷胱甘肽底物、合成的限速酶活性、清除活性氧等來(lái)抵抗氧化應(yīng)激帶來(lái)的損害[11-14]。在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)H2S的供體NaHS對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞砷暴露后的神經(jīng)損傷進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明外源性H2S能拮抗氟誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這與本研究前期過(guò)表達(dá)MST增加內(nèi)源性H2S發(fā)揮的保護(hù)效應(yīng)相一致[5]。

Hoechst33342/PI雙染法發(fā)現(xiàn)僅僅NaHS暴露48 h可降低細(xì)胞凋亡率，而流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，NaHS預(yù)處理24或48 h均不影響細(xì)胞凋亡率，似乎矛盾。實(shí)際上，本研究分析可能原因是熒光雙染法鏡下拍照是局部，側(cè)重定性、形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；而流式是針對(duì)所有細(xì)胞，側(cè)重計(jì)數(shù)、較準(zhǔn)確，兩種檢測(cè)手段不同因此出現(xiàn)這種差別。在本實(shí)驗(yàn)中，NaHS不能逆轉(zhuǎn)低濃度20 μmol/L NaAsO2造成的細(xì)胞凋亡，但卻能逆轉(zhuǎn)高濃度40 μmol/L NaAsO2引起的細(xì)胞凋亡。研究表明，砷對(duì)人胚胎肺纖維母細(xì)胞存在雙向效應(yīng)，低濃度通過(guò)激活ERK1/2促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；而高濃度則激活JNK促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。低濃度砷暴露的HaCat細(xì)胞通過(guò)GSK-3β/Cyclin D1,p21 and p27磷酸化促進(jìn)細(xì)胞周期從G1向S/G2M期轉(zhuǎn)換、促進(jìn)細(xì)胞增殖[16]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，低濃度NaAsO2引起凋亡的機(jī)制不同于高濃度[17]，或許是不能被H2S所逆轉(zhuǎn)的一個(gè)原因。

Caspase-12是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白，可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激多種途徑激活，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性的調(diào)節(jié)因子；Caspase-12一旦被激活就可以啟動(dòng)下游的凋亡路徑[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中，砷暴露無(wú)論24還是48 h均可抑制Caspase-12蛋白表達(dá)；但是只有24 h砷暴露后cleaved Caspase-12表達(dá)升高，而48h砷暴露后cleaved Caspase-12蛋白表達(dá)無(wú)顯著改變，提示剪切激活的Caspase-12僅在應(yīng)激早期發(fā)生改變；并且在此時(shí)間窗口內(nèi)增加的cleaved Caspase-12蛋白表達(dá)可被H2S拮抗。有報(bào)道，創(chuàng)傷引起的繼發(fā)性心臟損傷時(shí)caspase-12最早激活，活性和表達(dá)在創(chuàng)傷后3 h明細(xì)升高，6 h達(dá)高峰；予caspase-12特異性抑制劑Z-ATAD-FMK則心肌凋亡明顯降低[20]。然而，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，砷暴露48 h后cleaved Caspase-12未見改變，但細(xì)胞凋亡率可被H2S拮抗。有可能是過(guò)了Caspase-12激活的時(shí)間窗口所致。然而，砷暴露24 h后cleaved Caspase-12顯著增加，可被H2S拮抗，但細(xì)胞凋亡率卻未被拮抗，是何原因？目前尚不明了，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以研究。