腫瘤酸性微環(huán)境對(duì)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞遷移能力和F-actin表達(dá)的影響*

邱煒， 童璐， 黃瑾， 曾柱

(貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)是一種具有強(qiáng)大抗原攝取和處理能力的抗原提呈細(xì)胞，包括未成熟DCs(immol/Lature DCs, imDCs)以及成熟DCs(mature DCs, mDCs)兩個(gè)分化階段[1]。imDCs位于皮膚、黏膜等外周組織，主要功能為攝取和處理抗原[1]；獲得抗原后，imDCs遷移向二級(jí)淋巴組織，遷移過(guò)程中逐漸分化為mDCs[1-2]。在腫瘤免疫中，DCs遷移到淋巴結(jié)內(nèi)向初始T細(xì)胞呈遞腫瘤抗原進(jìn)而誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答[3-4]，然而實(shí)際在癌癥患者體內(nèi)DCs不能有效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境對(duì)DCs的遷移能力和免疫功能的影響是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要原因之一[5-8]。酸性是腫瘤微環(huán)境的一個(gè)顯著的生物學(xué)特性，具有抑制機(jī)體抗腫瘤免疫、促進(jìn)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移功能[9-11]。腫瘤微環(huán)境的pH 5.8～7.4，主要來(lái)源于碳酸和乳酸[12]。除此之外，腫瘤細(xì)胞還表達(dá)空泡質(zhì)子泵和Na+/H+交換體等離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，將胞內(nèi)高代謝產(chǎn)生的大量H+泵出胞外，從而導(dǎo)致胞外微環(huán)境低pH[13-15]。目前，相關(guān)實(shí)驗(yàn)分別從酸度和乳酸2個(gè)指標(biāo)來(lái)研究腫瘤酸性微環(huán)境對(duì)DCs免疫功能的影響，主要是檢測(cè)對(duì)其表面分子表達(dá)的影響[11]。在腫瘤微環(huán)境中，imDCs與腫瘤抗原結(jié)合，然后遷移到淋巴結(jié)內(nèi)向初始T細(xì)胞呈遞腫瘤抗原從而引起免疫應(yīng)答，遷移過(guò)程中imDCs成熟為mDCs[3-4]。本項(xiàng)目通過(guò)調(diào)節(jié)酸度和乳酸來(lái)研究腫瘤酸性微環(huán)境對(duì)imDCs遷移能力和絲狀肌動(dòng)蛋白(filament actin,F-actin)表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物來(lái)源 6～8周齡雄性 C57BL/6小鼠20只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃、無(wú)菌環(huán)境下，處理前禁食1 d。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，L-(+)-乳酸(美國(guó)Sigma公司)，重組鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinat Mouse GM-CSF，rmGM-CSF)和重組鼠白細(xì)胞介素4(recombinat Mouse IL-4，rmIL-4；美國(guó)Biolegend公司)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)、Cell Counting Kit 8(CCK8)、羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽及Triton-X100(北京索萊寶科技有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，臺(tái)式低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1小鼠處理 小鼠麻醉處死，75%濃度酒精浸泡小鼠10 min，將小鼠放置于解剖操作臺(tái)上、固定四肢。剪下小鼠的后腿、小心剔去附著的肌肉和結(jié)締組織，取出脛骨與股骨，將其浸泡在75%濃度酒精中5 min，放入消毒過(guò)的超凈工作臺(tái)上備用。

1.2.2imDCs的誘導(dǎo)及處理 取小鼠股骨與脛骨，無(wú)菌剪刀剪斷兩端，RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1 100 r/min離心5 min，棄上清、加紅細(xì)胞裂解液，1 100 r/min 離心5 min，棄上清、洗滌，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞而獲得骨髓細(xì)胞懸液。利用rmGM-CSF和rmIL-4定向誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞7 d 獲得小鼠 imDCs后，進(jìn)行酸度和乳酸處理實(shí)驗(yàn)。24 h后收集處理細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞活力檢測(cè) 利用CCK8試劑盒檢測(cè)imDCs活力。酸度處理實(shí)驗(yàn)中，imDCs分為4組，分別加pH7.3(對(duì)照)、pH6.8、pH6.5和pH5.8條件的RPMI-1640培養(yǎng)基；乳酸處理實(shí)驗(yàn)中，imDCs分為4組，分別加含0(對(duì)照)、10、20和40 mmol/L乳酸的RPMI-1640培養(yǎng)基。96孔板中培養(yǎng)各組imDCs(100 μL/孔)24 h，加CCK8溶液(10 μL/孔)，37 ℃、5%CO2條件孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各個(gè)孔吸光度。

1.2.4imDCs遷移能力檢測(cè) 采用Transwell系統(tǒng)測(cè)定imDCs的遷移能力。分別收集不同酸度(pH7.3和pH6.5)和乳酸(0和20 mmol/L)處理后的細(xì)胞，置于Transwell上室，下室放在預(yù)先加入RPMI-1640培養(yǎng)基的孔板中，37 ℃、5% CO2條件下24 h，收集 Transwell下室的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，獲得的數(shù)值與所加入的細(xì)胞總數(shù)之比為細(xì)胞遷移率。

1.2.5共聚焦激光掃描顯微鏡分析 分別收集酸度(pH7.3和pH6.5)和乳酸 (0和20 mmol/L)處理后的細(xì)胞，用4%多聚甲醛常溫固定細(xì)胞20 min后吸棄，洗滌、加Triton-100、吸棄，加羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽避光染色12 h、漂洗，加DAPI避光靜置5 min、漂洗，加防熒光淬滅劑油后封片、4 ℃避光保存；使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察、拍照、并用ImageJ軟件測(cè)量細(xì)胞熒光強(qiáng)度(F-actin表達(dá)量)。每個(gè)處理組隨機(jī)選擇3個(gè)細(xì)胞測(cè)定熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力

不同酸度處理結(jié)果顯示，處理imDCs 24 h，與pH7.3組的細(xì)胞活力相比，pH6.8和pH6.5組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pH5.8組細(xì)胞活力下降(P<0.01)；乳酸處理結(jié)果顯示，與0 mmol/L組細(xì)胞活力相比，10和20 mmol/L乳酸組細(xì)胞活力的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，40 mmol/L組細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01，圖1)。因此在后續(xù)酸度處理實(shí)驗(yàn)中分別將pH7.3和pH6.5處理imDCs 24 h作為對(duì)照組和處理組，而乳酸處理實(shí)驗(yàn)中分別將0和20 mmol/L濃度處理作為對(duì)照組和處理組。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.01；(2)與0 mmol/L組比較，P<0.01。圖1 腫瘤酸性微環(huán)境對(duì)imDCs活力的影響Fig.1 Effects of tumor acidic microenvironment on imDCs viability

2.2 imDCs遷移能力

不同pH處理imDCs 24 h，與pH7.3組相比，pH6.5組imDCs遷移率降低(P<0.05)；乳酸處理imDCs 24 h，與0 mmol/L組相比，20 mmol/L乳酸組imDCs遷移率明顯降低(P<0.01，圖2)。結(jié)果表明，腫瘤酸性微環(huán)境顯著抑制imDCs的遷移能力。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.05；(2)與0 mmol/L組比較，P<0.01。圖2 腫瘤酸性微環(huán)境對(duì)imDCs遷移能力的影響Fig.2 Effect of tumor acidic microenvironment on migration of imDCs

2.3 腫瘤酸性微環(huán)境抑制F-actin的表達(dá)

不同酸度處理imDCs 24 h，與pH7.3組相比，pH6.5組F-actin表達(dá)明顯降低(P<0.01，圖3)；乳酸處理imDCs 24 h，與0 mmol/L組相比，20 mmol/L乳酸組F-actin表達(dá)明顯降低(P<0.01，圖4)。結(jié)果表明，腫瘤酸性微環(huán)境顯著抑制imDCs的F-actin表達(dá)。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.01。圖3 酸度對(duì)imDCs 中F-actin表達(dá)的影響(600×)Fig.3 Effect of acidity on expression of F-actin in imDCs(600×)

注：(1)與0 mmol/L組比較，P<0.01。圖4 乳酸對(duì)imDCs 中F-actin表達(dá)的影響(600×)Fig.4 Effect of lactic acid on expression of F-actin in imDCs(600×)

3 討論

基于DCs在機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要地位，以DCs為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫治療已成為抗腫瘤治療手段之一，目前已開(kāi)發(fā)出多種療法，然而從臨床試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，這些療法的治療效率還不盡人意，存在許多待解決問(wèn)題，包括腫瘤的免疫逃逸、腫瘤抗原的選擇和負(fù)載方法以及過(guò)繼回輸時(shí)間間隔等[1,3]。目前在尋找新的優(yōu)化DCs腫瘤疫苗的研究中，如何解除腫瘤免疫抑制進(jìn)而恢復(fù)機(jī)體中DCs免疫學(xué)功能一直是待解決的重要問(wèn)題[4,12]。因此，通過(guò)對(duì)腫瘤微環(huán)境中DCs生物學(xué)功能的研究，為重塑其免疫功能提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，這對(duì)抗腫瘤免疫治療來(lái)說(shuō)具有重要意義。

DCs的遷移能力是發(fā)揮其免疫學(xué)功能的必要條件[1-2]。在荷瘤宿主體內(nèi)，DCs不能誘導(dǎo)有效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答，關(guān)鍵的原因是DCs的遷移能力被抑制[3,16]。酸性微環(huán)境是多種實(shí)體腫瘤微環(huán)境的顯著特征，其在腫瘤進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用[17-21]。因此，了解酸性腫瘤微環(huán)境對(duì)DCs遷移能力的影響對(duì)進(jìn)一步理解腫瘤免疫來(lái)說(shuō)具有重要意義。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤酸性微環(huán)境能顯著抑制imDCs遷移，這可能是荷瘤宿主中DCs未能遷移到淋巴結(jié)進(jìn)而導(dǎo)致荷瘤宿主免疫功能受損的重要原因之一。

細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)有序性方面起重要作用，主要包括微管、微絲和中間纖維[22-24]。由F-actin構(gòu)成的微絲能控制細(xì)胞遷移能力[24]。F-actin 是多個(gè)球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)亞基組成的絲狀聚合物[25]。F-actin和G-actin的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)DCs的抗原捕獲、遷移能力等功能至關(guān)重要[25-27]。在本實(shí)驗(yàn)中，羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽只能特異性標(biāo)記F-actin，而不是與G-actin結(jié)合。結(jié)果顯示細(xì)胞外酸性微環(huán)境使imDCs中F-actin含量顯著降低，提示酸性微環(huán)境可能使F-actin發(fā)生了解聚。由于F-actin與DCs的遷移能力密切相關(guān)，因此酸性微環(huán)境很可能通過(guò)調(diào)控F-actin聚合進(jìn)而影響imDCs的遷移能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤酸性微環(huán)境能抑制imDCs遷移能力和F-actin的表達(dá)。