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    馬勃止血活性部位的篩選研究*

    2020-12-02 13:49:04張曉臣
    化學(xué)工程師 2020年11期
    關(guān)鍵詞:馬勃瓷板云南白藥

    隋 新,李 鵬,謝 洋,付 東,張曉臣

    (黑龍江省科學(xué)院 高技術(shù)研究院,黑龍江 哈爾濱150020)

    馬勃(Lasiosphaera Calvatia)別名灰包、馬糞包,是一類擔(dān)子菌門的真菌通稱,始載于《名醫(yī)別錄》,其干燥子實(shí)體可入中藥,具有止血、抗菌、抗癌等功效,臨床上用于多種出血性疾病,如口腔出血、消化道出血及外傷出血等。自20世紀(jì)60年代以來,由于馬勃特殊的藥理作用,使其倍受醫(yī)藥界的關(guān)注。中國(guó)藥典2005版規(guī)定灰包科脫皮馬勃、大馬勃和紫色馬勃的干燥子實(shí)體做為藥用馬勃正品[1]。馬勃藥材在我國(guó)資源豐富,生于曠野草地,產(chǎn)于內(nèi)蒙、遼寧、安徽、甘肅、江蘇、云南等地區(qū)[2]。

    盡管馬勃具有較好的藥理作用[3-6],但大部分研究?jī)H僅是對(duì)其中所含的化合物進(jìn)行提取分離,雖然從中得到了不少種類的化合物,現(xiàn)已證實(shí)的有氨基酸[7]、甾類化合物[8]、萜類化合物[9]、馬勃多糖[10]、多肽和蛋白質(zhì)[11,12],還有一些其它成分如微量元素等,但是對(duì)其化合物的藥理活性研究較少。因此,本文利用活性物追蹤分離的方式,采用體外凝血實(shí)驗(yàn),利用加熱回流提取、有機(jī)溶劑萃取等方式對(duì)馬勃中止血活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化,最終得到止血活性部位,此研究將為新型藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ),為馬勃資源的合理利用及藥用部位的確定提供參考。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器、試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

    QE-200型高速萬能粉碎機(jī)(浙江屹立工貿(mào)有限公司);EYEL4型平行反應(yīng)儀(東京理化器械株式會(huì)社);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);FD-2型凍干機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);K61型秒表(上海星鉆秒表有限公司);CS501-SP型水浴鍋(重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠);6孔白陶瓷板(上海壘固儀器有限公司)。

    95%乙醇(AR西隴化工股份有限公司);石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇,均為分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;枸櫞酸鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);生理鹽水(吉林省廣春藥業(yè)有限公司);蒸餾水(自制)。

    健康實(shí)驗(yàn)用哈長(zhǎng)耳白兔(體質(zhì)量2.0~2.5kg,雄性,購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心);云南白藥(云南白藥股份有限公司,規(guī)格:4g,批號(hào):ZDA1602,購(gòu)于哈爾濱聯(lián)想億百大藥房連鎖有限公司);馬勃藥材購(gòu)于南極藥材批發(fā)市場(chǎng)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 提取方法 取馬勃干燥藥材適量,用粉碎機(jī)粉碎,溶劑為水、45%乙醇、95%乙醇,固液比1∶15,加熱回流提取3次,每次2h,提取結(jié)束后過濾得上清液,合并濾液,減壓回收溶劑,冷凍干燥,得固形物,稱重,計(jì)算得率。

    1.2.2 萃取方法 按照1.2.1項(xiàng)下提取方法將提取液濃縮至無醇味時(shí)停止,按照提取液與溶劑比例為1∶1,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到不同萃取層,減壓回收溶劑,冷凍干燥,得固形物,稱重,計(jì)算得率。

    1.2.3 體外凝血實(shí)驗(yàn)

    1.2.3.1 瓷板針挑法 在白瓷板的凹坑內(nèi),分別加入濃度為5mg·mL-1樣品0.1mL,再分別加入CaCl2溶液0.1mL,用大頭針把藥液與CaCl2溶液混勻,最后分別同時(shí)加入抗凝血液0.5mL,立即計(jì)時(shí),迅速用大頭針攪拌混勻且攪拌次數(shù)一致。以云南白藥為陽性對(duì)照,并設(shè)空白對(duì)照。以后每30s用大頭針穿過血液輕挑1次,當(dāng)出現(xiàn)血絲時(shí)為開始凝血,當(dāng)推動(dòng)血塊時(shí),露出瓷板白底即算血液完全凝固。從加入抗凝血液到血液完全凝固時(shí)間為凝血時(shí)間。

    1.2.3.2 試管法 取內(nèi)徑為8mm,長(zhǎng)10cm的玻璃潔凈試管,每管分別加入濃度為5mg·mL-1樣品0.1mL,再加入CaCl2溶液0.1mL,搖勻,在37℃水浴溫浴1min,然后于各管內(nèi)同時(shí)加入兔血0.5mL,以云南白藥為陽性對(duì)照,并設(shè)空白對(duì)照,蓋緊,倒轉(zhuǎn)3次,立即計(jì)時(shí),在37℃的水浴箱中觀察,每隔30s輕輕傾斜試管1次,角度為30°,觀察血液是否流動(dòng),直至傾斜到90°血液不再流動(dòng)而完全凝固于試管底為止,即為凝血時(shí)間。

    1.2.3.3 復(fù)鈣時(shí)間測(cè)定 取內(nèi)徑為8mm,長(zhǎng)10cm的潔凈玻璃試管,每管分別加入濃度為5mg·mL-1樣品0.1mL,加入的CaCl2溶液0.1mL,搖勻,在37℃水浴溫浴1min,再于各管內(nèi)同時(shí)加入0.1mL的血漿,同時(shí)開動(dòng)秒表計(jì)時(shí),每隔15s傾斜試管1次,在混合液中開始出現(xiàn)彌漫的白色顆粒纖維蛋白絲時(shí),即為復(fù)鈣時(shí)間。以云南白藥為陽性對(duì)照,并設(shè)空白對(duì)照。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次,數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn),若P<0.05為差異有顯著性,P<0.01為差異極顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 活性提取物的確定

    采用不同濃度(v/v)乙醇對(duì)馬勃活性物進(jìn)行提取,得到3種提取物,分別為馬勃水提取物、45%乙醇提取物及95%乙醇提取物,得率見圖1。

    圖1 馬勃各提取物得率對(duì)比Fig.1 Comparison of yield of Lasiosphaera Calvatia extract

    從圖1中可以看出,隨著乙醇濃度的升高,活性物得率也在增加。得率的增加可能是因?yàn)橐掖紳舛仍礁咂茐恼婢?xì)胞壁的能力越強(qiáng),使可溶性物質(zhì)溶出。

    分別采用瓷板針挑法、試管法和復(fù)鈣時(shí)間對(duì)3種馬勃提取物進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖2。

    圖2 馬勃各提取物體外凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果(瓷板針挑法、試管法、復(fù)鈣時(shí)間測(cè)定)Fig.2 Results of clotting experiment of Lasiosphaera Calvatia extract in vitro

    從圖2可以看出,馬勃各提取物與空白對(duì)照組對(duì)比均有不同程度的差異,可以表明馬勃提取物能有效的縮短血液凝聚時(shí)間,其中45%乙醇提取物體外凝血效果最佳,所以本實(shí)驗(yàn)選擇45%乙醇提取物進(jìn)一步分離,尋找止血活性部位。

    2.2 活性部位的確定

    通過體外凝血實(shí)驗(yàn)篩選馬勃止血活性部位,由于45%乙醇提取物具有凝血活性,所以采用不同極性溶劑對(duì)其依次萃取,得率見圖3。

    圖3 馬勃各萃取部位得率對(duì)比Fig.3 Comparison of yield of Lasiosphaera Calvatia extraction fraction

    從圖3中可以看出,隨著萃取溶劑極性的增強(qiáng),得率也在增加。

    馬勃不同萃取部位凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5種馬勃萃取物和云南白藥陽性對(duì)照組,與空白實(shí)驗(yàn)組相比均有不同程度的差異,說明馬勃各萃取部位均能有效的縮短血液凝聚時(shí)間。

    圖4 馬勃各萃取部位體外凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果(瓷板針挑法、試管法、復(fù)鈣時(shí)間測(cè)定)Fig.4 Results of clotting experiment of Lasiosphaera Calvatia extraction fraction in vitro

    從圖4可以看出,馬勃各萃取部位與空白對(duì)照組對(duì)比均有顯著性差異(p<0.05),其中正丁醇部位具有較好的止血效果。

    3 結(jié)論

    本文通過活性物追蹤分離的方式,采用加熱回流法對(duì)馬勃活性物進(jìn)行提取,通過體外凝血實(shí)驗(yàn)篩選出馬勃止血活性提取物;對(duì)此提取物通過液液萃取的方式從低極性到高極性依次萃取,進(jìn)一步通過體外凝血實(shí)驗(yàn)篩選出馬勃止血活性部位(正丁醇部位),這為以后活性成分的捕捉提供理論基礎(chǔ)。

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