測流層析技術(shù)標(biāo)記材料的研究進(jìn)展*

薛佳瑩，崔向紅，曹滌非，黃國慶，王 雷

（黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱150020）

測流層析技術(shù)是基于毛細(xì)管作用力的移動速度差異，在反應(yīng)基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)分離的色譜技術(shù)。測流層析技術(shù)由4個部分組成：樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊（如下圖所示）。樣品墊為經(jīng)過處理的纖維膜，用于快速吸收待測樣品。結(jié)合墊多采用纖維膜或玻璃棉，負(fù)載有標(biāo)記材料（如金標(biāo)抗體），檢測時標(biāo)記材料與待檢樣品中的靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合形成可檢測的復(fù)合物。層析膜主要使用硝酸纖維素膜，其上噴印檢測線和質(zhì)控線，用于顯色標(biāo)記的復(fù)合物，觀察檢測結(jié)果。吸水墊為吸水紙板，使樣品在層析膜上側(cè)向流動。測流層析技術(shù)（Lateral flow chromatographic assay）是檢測食源性致病菌，腫瘤標(biāo)志物，重金屬，農(nóng)藥等簡單快速靈敏的檢測技術(shù)。其具有成本低，易操作，快速，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[1]。

圖1 測流層析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of lateral flow chromatography strip

標(biāo)記材料是影響測流層析技術(shù)靈敏度的關(guān)鍵因素之一。目前應(yīng)用最廣泛的是膠體金標(biāo)記材料。這種標(biāo)記材料不需要輔助儀器進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，但其靈敏度偏低。為了提高測流層析技術(shù)檢測的穩(wěn)定性與靈敏度，研究者們一直在不斷探索尋找新的標(biāo)記材料。本文就近年來出現(xiàn)的測流層析技術(shù)標(biāo)記材料進(jìn)行綜述，并對其在農(nóng)藥殘留檢測方面的應(yīng)用進(jìn)行分析。

1 膠體金材料

膠體金（Collodical gold）是氯金酸中的金離子被還原成金顆粒，形成的膠體溶液。這種膠體溶液對蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的吸附能力，可與免疫球蛋白，多肽等非共價結(jié)合。在測流層析技術(shù)中膠體金顆粒在相應(yīng)配體處大量聚集，形成肉眼可見的紅色條帶。是目前使用最多的標(biāo)記材料[2]。膠體金非常穩(wěn)定，粒徑在20～40nm的膠體金最為適合做免疫層析實(shí)驗(yàn)。膠體金的標(biāo)記受多種因素影響，如膠體金的酸堿度和配體蛋白的比例等。因此，需要對pH值、抗體加入量等因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以得到最優(yōu)條件的免疫金。目前，已成功開發(fā)出多種金納米顆粒標(biāo)記試紙用于檢測殺蟲劑等農(nóng)藥（見表1）。膠體金測流層析技術(shù)以其操作簡單，方便快捷的優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留檢測中發(fā)揮了重要作用。

表1 膠體金試紙?jiān)谵r(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用Tab.1 Application of colloidal gold strip in the field of pesticide detection

2 膠體碳材料

膠體碳是碳黑經(jīng)過表面處理所得膠體溶液。碳黑是一種表面積大的無定形碳。碳黑經(jīng)過處理，引入羰基，羥基等親水性的有機(jī)官能團(tuán)，形成穩(wěn)定性好的膠體碳。膠體碳有較好的靈敏度，其黑色信號與白色硝酸纖維素膜對比明顯，并且較膠體金材料更加環(huán)保。魏艷秋等建立了膠體碳側(cè)流免疫層析法檢測埃博拉病毒[9]。研究者開發(fā)的膠體碳檢測試紙最低檢出限為100ng·mL-1，具有良好的特異性和穩(wěn)定性，為快速檢測提供了新的方法。曾艷等研制了以SB4型炭黑為標(biāo)記材料的膠體碳檢測試紙條，用于呋喃妥因代謝物的檢測，其檢測限為0.2μg·kg-1，可在15min內(nèi)完成檢測[10]。試紙操作方便，可用于大量樣品的快速檢測。

3 量子點(diǎn)材料

量子點(diǎn)（quantum dots,QDs）是由元素周期表中II～VI族或III～V族元素，兩種或兩種以上復(fù)合材料構(gòu)成的納米級別的半導(dǎo)體材料，粒徑一般介于1～100nm之間[11]。量子點(diǎn)擁有窄發(fā)射光譜，寬激發(fā)范圍，以及良好的穩(wěn)定性。量子點(diǎn)標(biāo)記可提高測流層析技術(shù)的靈敏度。由于量子點(diǎn)尺寸小，易團(tuán)聚，在其做為標(biāo)記材料與抗體連接之前需要先進(jìn)行化學(xué)修飾[12]。量子點(diǎn)經(jīng)過化學(xué)修飾后可以進(jìn)行特異性鏈接，其細(xì)胞毒性低，可進(jìn)行生物標(biāo)記檢測。Chen等研究者構(gòu)建了基于量子點(diǎn)的電化學(xué)發(fā)光檢測方法，用于檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留[13]。使用還原石墨烯氧化物-碲化鎘量子點(diǎn)為陰極，羧基共軛聚合物為陽極。乙酰膽堿酯酶和膽堿酯酶發(fā)生酶促反應(yīng)，消耗O2產(chǎn)生H2O2，此時陰極的石墨烯量子點(diǎn)信號因?yàn)槿芙庋醯南臅p弱。陽極信號隨著H2O2含量的增加而增強(qiáng)。當(dāng)目標(biāo)檢測物質(zhì)有機(jī)磷農(nóng)藥加入時，其特異性與乙酰膽堿酯酶結(jié)合，使酶活性下降。陽極信號會減弱，陰極信號會增強(qiáng)。這種電化學(xué)發(fā)光檢測方法的檢測限為0.125pM，線性檢測范圍為0.5pM～50nM。宋春霞等研制了一種基于CdTe量子點(diǎn)的熒光分析試紙用于檢測水樣中的Cu2+，可實(shí)現(xiàn)低至5μmol·L-1Cu2+的快速檢測，為水體檢測提供了一種新的快速方法[14]。與膠體金相比，量子點(diǎn)材料提高了檢測的靈敏度。這是由量子點(diǎn)材料高信噪比的特點(diǎn)決定的。只是其數(shù)據(jù)讀取需要外加紫外光源，結(jié)果判定復(fù)雜一些。

4 磁性材料

磁性材料經(jīng)過化學(xué)修飾后，具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，目前己經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物檢測和分離當(dāng)中[15,16]。納米級的磁性材料，可與抗體結(jié)合形成免疫磁珠。磁珠能對樣品中分析物進(jìn)行預(yù)濃縮和純化，顯著提高靈敏度?；诖判约{米顆粒標(biāo)記的測流層析技術(shù)己經(jīng)廣泛用于研究檢測不同種類的蛋白質(zhì)，如抗原[17]、腫瘤標(biāo)記物[18]等。

Liu等研究者建立了磁性納米材料標(biāo)記的農(nóng)藥對氧磷殘留檢測試紙條。這種采用多聚賴氨酸和羰基交聯(lián)制備出的磁性納米材料的靈敏度較未交聯(lián)的磁性材料Fe3O4母體高出40倍。最低檢測線為1.7ng·mL-1[19]。洪立新等研究者將磁性納米珠與單克隆抗體偶聯(lián)，構(gòu)建了針對心肌肌鈣蛋白I（cTnI），肌酸激酶同工酶MB（CKMB）和肌紅蛋白（Myo）3種心臟標(biāo)志物的免疫層析試紙條[20]。測得定量下限cTnI為0.03ng·mL-1，CKMB為0.21ng·mL-1，Myo為0.17ng·mL-1。實(shí)現(xiàn)了對心梗三項(xiàng)的快速，特異性檢測。

5 其它材料

為了提高測流層析試紙檢測的精確度和靈敏度，研究者們不斷的努力尋找新的特異性高，靈敏度好的標(biāo)記材料。Cheng報(bào)道了一種使用Pt-Ni（OH）2納米材料檢測農(nóng)藥乙草胺，甲氰菊酯的二維測流層析檢測方法[21]。研究者采用兩步微波法制備Pt-Ni（OH）2納米片層標(biāo)記材料，再將其與抗體結(jié)合用于檢測目標(biāo)農(nóng)藥。所制得的試紙條對乙草胺和甲氰菊酯的檢測限為0.63ng·mL-1和0.24ng·mL-1。研究者檢測了玉米，蘋果，卷心菜等實(shí)際樣品，所得結(jié)果與氣相色譜結(jié)果一致。研究者還開發(fā)了結(jié)合Android智能手機(jī)拍照功能的檢測系統(tǒng)Strip Scan app，可進(jìn)行快速定量分析。

華修德等研究者建立了一種上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標(biāo)記的農(nóng)藥氯噻啉層析檢測方法[22]。將氨基功能化的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料與氯噻啉單克隆抗體偶聯(lián)制備層析試紙條，使用外接980nm激光光源的熒光分光光度計(jì)實(shí)現(xiàn)對氯噻啉的定量檢測。在最優(yōu)條件下，可在25min內(nèi)完成檢測，試紙條對氯噻啉的檢出限為26.30ng·mL-1。上轉(zhuǎn)換納米材料是目前研究較多的一類稀土摻雜無機(jī)發(fā)光材料。Zou Rubing等研制了采用上轉(zhuǎn)換納米材料標(biāo)記的3種有機(jī)磷農(nóng)藥檢測試紙[23]。該試紙可在0.98～250ng·mL-1濃度范圍內(nèi)進(jìn)行甲基對硫磷，對硫磷，殺螟硫磷的殘留檢測。上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料是反斯托克斯發(fā)光，其激發(fā)波長一般是近紅外或紅外光，發(fā)射出紫外或可見光。作為一種新型生物熒光標(biāo)記物，其具有發(fā)射譜帶窄、熒光背景低、無光漂白等優(yōu)點(diǎn)。

6 結(jié)論和展望

測流層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測方面與氣相色譜，液相色譜，質(zhì)譜等方法相比，具有快速，便捷，操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。標(biāo)記材料在檢測中起著連接抗體，顯色的重要作用。其提供的檢測信號決定了檢測方法的特異性和靈敏度。傳統(tǒng)的測流層析標(biāo)記材料主要是膠體金，其主要通過非共價作用與抗體結(jié)合，檢測靈敏度偏低，結(jié)果不能準(zhǔn)確定量。為此，研究者們不斷努力開發(fā)新的標(biāo)記材料。量子點(diǎn)上轉(zhuǎn)換納米顆粒等新型材料在信號強(qiáng)度，穩(wěn)定性方面較膠體金有很大提升。這些材料其表面需要修飾功能基團(tuán)，然后通過共價鍵與抗體結(jié)合。在制備方法和使用條件方面需要進(jìn)一步的研究，但其高靈敏度，高特異性的優(yōu)點(diǎn)在未來測流層析檢測試紙方向?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。