生態(tài)濕地中抗生素抗性基因的污染控制研究*

鄭 吉 郭 莉 劉 揚(yáng) 周振超 陳 紅 商衛(wèi)純

(1.寧波市生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院，浙江 寧波 315012；2.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 310058)

生態(tài)濕地是通過(guò)人工模擬自然濕地的結(jié)構(gòu)和功能而設(shè)計(jì)和建造的濕地，主要由基質(zhì)、植物、微生物等組成，它充分利用物理、化學(xué)和生物的三重協(xié)同作用，通過(guò)過(guò)濾、吸附、沉淀、離子交換、植物吸收和微生物分解等作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)污水的高效凈化[1]。不同類型的生態(tài)濕地對(duì)不同污染物的處理能力存在較明顯差異，因此能夠有針對(duì)性地處理不同污染物[2-3]。近年來(lái)納米材料、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、抗生素抗性基因(ARGs)等新型污染物在水體中不斷被檢出。這些新型污染物雖然并沒(méi)被列為水質(zhì)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，但是已有許多研究表明這些新型污染物在環(huán)境中的富集對(duì)人及其他生物將產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。

飲用水水源中ARGs的檢出對(duì)飲用水處理工藝提出了更高的要求[6]。生態(tài)濕地雖然已經(jīng)被廣泛證實(shí)可有效去除水中有機(jī)物、氮、磷、重金屬等污染物[7-8]，但其對(duì)ARGs去除效果的相關(guān)研究較少。

寧波某水庫(kù)控制集雨面積為259 km2，總庫(kù)容為1.198億m3[9]15，目前是寧波市級(jí)飲用水源地之一。該水庫(kù)生態(tài)濕地依據(jù)原有魚塘改造而成，作為飲用水預(yù)處理工程承擔(dān)著流域富營(yíng)養(yǎng)化防治的任務(wù)[10]4817。本研究以該水庫(kù)生態(tài)濕地為研究對(duì)象，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法探究了此生態(tài)濕地各模塊出水中8種常見(jiàn)的ARGs(β內(nèi)酰胺類抗性基因blaOXA-48、blaTEM，磺胺類抗性基因sul1、sul2，四環(huán)素類抗性基因tetO、tetW，大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermX、ermB)、一類整合子(intI1)與16S rRNA的控制情況。另外，本研究還探究了該生態(tài)濕地中ARGs與16S rRNA、intI1間的相關(guān)性，為探索生態(tài)濕地對(duì)ARGs的去除效果提供數(shù)據(jù)與支撐。

1 材料與方法

1.1 生態(tài)濕地總體布局

寧波某水庫(kù)生態(tài)濕地占地4.33 hm2，凈水能力5萬(wàn)t/d，設(shè)計(jì)平均水深為1.2 m，水力停留時(shí)間為20 h。該生態(tài)濕地由水杉涵養(yǎng)林生態(tài)溝凈化系統(tǒng)、多級(jí)強(qiáng)化生物膜系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)鹽集約式植物資源化系統(tǒng)、高效自凈水生態(tài)系統(tǒng)、生態(tài)濾地系統(tǒng)這5個(gè)子系統(tǒng)組成，包含15 個(gè)濕地模塊。各模塊結(jié)構(gòu)[9]17,[10]4817如表1所示。

表1 生態(tài)濕地各模塊的結(jié)構(gòu)

溪水從堰壩經(jīng)引水管流入生態(tài)濕地，自生態(tài)濕地的A-1流至C-2后分成2股(A線和B線)分別流向C-6和C-8，匯合于D-1， 經(jīng)E-1流入水庫(kù)，具體流程見(jiàn)圖1。

注：A線為A-1→B-1→C-1→B-2→C-2→C-3→C-4→B-3→C-6→D-1→E-1；B線為A-1→B-1→C-1→B-2→C-2→C-5→B-4→C-7→C-8→D-1→E-1。

1.2 樣品采集

對(duì)生態(tài)濕地各模塊的進(jìn)出水進(jìn)行多次采樣，分別于2019年3、6、9月采集16個(gè)樣品(包括進(jìn)水(即原水))的3次平行樣，每個(gè)樣品采樣2 L。樣品存放在含有冰塊的采樣箱中低溫保存，并在12 h之內(nèi)完成水樣預(yù)處理。采集樣品時(shí)，用便攜式pH計(jì)(HQ11d)和溶解氧儀(LDOTM)測(cè)定濕地進(jìn)出水樣品的溫度、pH和溶解氧。

水樣脫氧核糖核酸(DNA)提取的預(yù)處理：采用抽濾方式富集微生物，用0.22 μm濾膜進(jìn)行真空抽濾。隨后采用FastDNA Spin Kit for soil試劑盒(MP，美國(guó))進(jìn)行DNA提取。DNA濃度采用微量分光光度儀(ND-1000)測(cè)定，置于-85 ℃保存。

1.3 常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

對(duì)2019年6月生態(tài)濕地整體進(jìn)出水樣品進(jìn)行COD、總氮、總磷、氨氮、總有機(jī)碳(TOC)的測(cè)定。COD的測(cè)定采用酸性高錳酸鉀氧化法，總氮的測(cè)定采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法，氨氮的測(cè)定采用納氏比色法，總磷的測(cè)定采用鉬酸銨分光光度法，TOC由TOC分析儀(5000TOCi)測(cè)定。

1.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR在Bio-rad IQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad IQTM5)中進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)體系放在96孔板中，其中包含7.5 μL SYBR溶液，0.3 μL ROX溶液，0.3 μL摩爾濃度為10 mmol/L的前后引物，4.6 μL超純水，2 μL 10 ng/μL的DNA樣品。引物見(jiàn)表2。反應(yīng)溫度程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性30 s后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后進(jìn)行55～95 ℃的熔解曲線分析。每個(gè)擴(kuò)增進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)，并采用空白實(shí)驗(yàn)來(lái)排查誤差。基因的絕對(duì)豐度由達(dá)到熒光閾值時(shí)所需的循環(huán)數(shù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS V22.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析、差異性分析，P<0.05被認(rèn)為存在顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)的去除效果

如表3所示，該生態(tài)濕地對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽具有較好的去除效果，總氮和氨氮的去除率最高，分別為51.6%和40.5%，總磷的去除率為37.5%。多級(jí)強(qiáng)化生物膜系統(tǒng)和營(yíng)養(yǎng)鹽集約式植物資源化系統(tǒng)等對(duì)氮磷的控制效果較好。此外，COD的去除率為26.2%，TOC的去除率為12.3%，生態(tài)濕地對(duì)飲用水源水質(zhì)凈化效果較好。

表2 引物序列

表3 常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)的去除效果

2.2 ARGs的豐度

對(duì)生態(tài)濕地各模塊出水中8種常見(jiàn)的ARGs檢測(cè)結(jié)果顯示，blaOXA-48、blaTEM、sul1、sul2、tetO、ermX6種ARGs均有不同程度地檢出。水樣中檢出的各類ARGs比例較為相似，其中磺胺類抗性基因sul1、sul2絕對(duì)豐度最高，約占總檢出ARGs的81.84%～88.97%，其次為四環(huán)素類抗性基因tetO(約占6.81%～13.68%)，兩者約占總檢出ARGs的92.02%～97.87%，β內(nèi)酰胺類抗性基因blaOXA-48、blaTEM和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermX絕對(duì)豐度較低?；前泛退沫h(huán)素類抗生素是較為廣泛使用的藥品，部分研究中也發(fā)現(xiàn)地表水中存在高豐度的磺胺類抗性基因和四環(huán)素類抗性基因[11-12]，這兩類ARGs需要引起關(guān)注。

ARGs的相對(duì)豐度為ARGs絕對(duì)豐度與16S rRNA的比值，代表著每個(gè)細(xì)菌中所含的ARGs拷貝數(shù)。生態(tài)濕地中ARGs的相對(duì)豐度如圖2所示。該生態(tài)濕地中細(xì)菌總體變化不大，16S rRNA絕對(duì)豐度在2.19×106～3.50×106拷貝數(shù)/L波動(dòng)，而ARGs的相對(duì)豐度在處理過(guò)程中大體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，出水中ARGs的相對(duì)豐度僅為進(jìn)水的26.69%。這意味著，攜帶ARGs的細(xì)菌在生態(tài)濕地中的比例逐步降低，這可能與生態(tài)濕地內(nèi)增加的微生物群落和非生物物質(zhì)有關(guān)[13]。

圖2 ARGs的相對(duì)豐度和16S rRNA的絕對(duì)豐度

雖然生態(tài)濕地出水中sul1、sul2、tetO等的絕對(duì)豐度低于同類研究對(duì)飲用水源的調(diào)查結(jié)果[14]，但ARGs相對(duì)豐度仍處于較高水平。這些ARGs排入水庫(kù)后隨著基因的垂直和水平轉(zhuǎn)移，其絕對(duì)豐度有可能會(huì)再次上升，對(duì)人體健康造成威脅[15]。因此，需要進(jìn)一步提升生態(tài)濕地對(duì)ARGs的去除能力。

2.3 ARGs的去除效果

圖3顯示的是該生態(tài)濕地A線、B線對(duì)4類ARGs的去除情況，采用秩和檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)ARGs絕對(duì)豐度的差異性。該生態(tài)濕地能顯著降低磺胺類抗性基因sul1、sul2和四環(huán)素類抗性基因tetO的絕對(duì)豐度(P<0.05)。sul1的去除率為73.9%，sul2的去除率為75.9%，tetO的去除率為80.2%。而對(duì)β內(nèi)酰胺類抗性基因blaOXA-48、blaTEM和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermX的去除效果較差。同類研究表明，生態(tài)濕地對(duì)污水中ARGs的去除率基本在87.8%左右[16]，生態(tài)濕地對(duì)水環(huán)境中ARGs的控制效果較好。不同水處理系統(tǒng)(曝氣生物濾池、生態(tài)濕地和紫外線消毒)對(duì)ARGs去除效果的比較研究中發(fā)現(xiàn)，生態(tài)濕地對(duì)ARGs的去除率為90%～99%，曝氣生物濾池的去除率為40%～90%，但紫外線消毒沒(méi)有明顯的效果，說(shuō)明生態(tài)濕地在ARGs去除方面具有優(yōu)勢(shì)，可以優(yōu)先成為污水處理廠進(jìn)一步去除ARGs的處理系統(tǒng)[17]。

生態(tài)濕地A線、B線ARGs的去除規(guī)律較為相似，這可能與A線、B線中所涉及的模塊組成較為相似有關(guān)。而不同生態(tài)濕地模塊對(duì)ARGs的去除率不同。高效自凈水生態(tài)系統(tǒng)主要由生態(tài)浮島組成，種植再力花、水生鳶尾、美人蕉、錢幣草，其對(duì)ARGs的去除率最高，約為33.9%。水杉涵養(yǎng)林生態(tài)溝凈化系統(tǒng)(14.8%)、多級(jí)強(qiáng)化生物膜系統(tǒng)(15.1%)的去除率次之，水杉涵養(yǎng)林生態(tài)溝凈化系統(tǒng)種植水杉、水生鳶尾、錢幣草、苦草、黑藻、伊樂(lè)藻，多級(jí)強(qiáng)化生物膜系統(tǒng)主要在懸掛彈性掛膜材料里種植高密度再力花、錢幣草、美人蕉、茭草。營(yíng)養(yǎng)鹽集約式植物資源化系統(tǒng)搭建生態(tài)溝，遴選濕生和水生高等植物進(jìn)行套作，其對(duì)ARGs的去除率約為8.4%。而生態(tài)濾地系統(tǒng)對(duì)ARGs無(wú)去除效果，反而使ARGs增加了9.4%。這可能是由于生態(tài)濾地系統(tǒng)主要為水洗砂和碎石填裝的三級(jí)垂直潛流濾床，種植植物單一。生態(tài)濕地對(duì)ARGs的去除可能主要與植物的根基有關(guān)。挺水植物比沉水植物處理效果好，這可能是因?yàn)橥λ参锷顒?dòng)更為旺盛，微生物環(huán)境比沉水植物復(fù)雜，對(duì)多種ARGs的削減潛能更大[18]。

圖3 生態(tài)濕地對(duì)ARGs的去除效果

2.4 相關(guān)性分析

整合子是一種可以在整合酶的作用下捕獲外源基因盒并在特定的位點(diǎn)進(jìn)行重組而使之表達(dá)的可移動(dòng)基因元件，同時(shí)整合子又可整合到質(zhì)粒上或自身作為轉(zhuǎn)座子的一個(gè)組成部分而參與轉(zhuǎn)移，成為環(huán)境中不同菌屬間ARGs傳播的重要途徑[19]。本研究對(duì)生態(tài)濕地中的intI1進(jìn)行調(diào)查，其絕對(duì)豐度為6.81×104～2.63×105拷貝數(shù)/L?；前奉惪剐曰騭ul1、sul2，四環(huán)素類抗性基因tetO與一類整合子intI1之間呈顯著的正相關(guān)性(P<0.05)，R2分別為0.82、0.91、0.93。一類整合子作為可移動(dòng)基因元件之一，在磺胺類抗性基因、四環(huán)素類抗性基因的傳播中具有重要作用[20]。因此對(duì)于水環(huán)境中sul1、sul2及tetO的削減和控制，應(yīng)關(guān)注一類整合子在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移行為特征。

3 結(jié) 論

(1) 生態(tài)濕地中磺胺類抗性基因和四環(huán)素類抗性基因絕對(duì)豐度較高，約占總檢出ARGs的92.02%～97.87%，β內(nèi)酰胺類抗性基因和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因較低。

(2) 生態(tài)濕地對(duì)磺胺類抗性基因和四環(huán)素類抗性基因去除率高，sul1的去除率為73.9%，sul2的去除率為75.9%，tetO的去除率為80.2%。

(3) 生態(tài)濕地不同模塊對(duì)ARGs的去除效果不同，可能與植物種植情況和植物種類有關(guān)。

(4) 生態(tài)濕地中ARGs與intI1之間存在相關(guān)性，ARGs的去除與intI1有關(guān)。