重組人白細胞介素15蛋白的制備和鑒定方法研究①

鄭燕平，黃 晶

(1.廈門大學附屬第一醫(yī)院腫瘤中心實驗室，福建 廈門 361001； 2.廈門特寶生物工程有限公司 ，福建 廈門361001)

白細胞介素15(interleukin 15，IL-15)可經活化的成纖維細胞、表皮細胞和單核巨噬細胞等多種細胞產生，與白細胞介素2具有相似的功能和結構，可以利用其受體的β鏈和γ鏈與靶細胞結合，是一種重要的多功能細胞因子。1994年，Grabstein K. H.等在檢測猿腎上皮細胞培養(yǎng)上清液時發(fā)現(xiàn)了這種細胞因子[1]。最初這種細胞因子被發(fā)現(xiàn)對T細胞具有化學趨化作用而促進T 細胞的活化增殖，之后該細胞因子具有調節(jié)B細胞、自然殺傷(NK)細胞、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、中性粒細胞和樹突狀細胞的功能也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，其通過與其它細胞因子相互作用在人體免疫調節(jié)和保護方面發(fā)揮了巨大的作用[2]。1995年這種細胞因子被正式命名為白細胞介素15。

近年來的研究表明，IL-15與許多自身免疫性疾病、變態(tài)反應性疾病及血液性疾病緊密相關[3]。IL-15廣泛參與人體免疫過程，在炎癥性疾病治療及抗腫瘤治療中具有獨特作用而備受人們關注[4,5]。

本文報道了制備和鑒定rhIL-15蛋白的方法，建立的HPLC和MALDI串聯(lián)質譜測定所制備的rhIL-15蛋白的方法能準確反映蛋白的純度和質量，為蛋白分析提供了重要的參考依據(jù)，具有較強的臨床研究價值。

1 材料和方法

1.1 材料

E.coli BL21(DE3)菌株，E. coli DH5α、pET-22b質粒購自Novagen公司。蛋白分子量標準購自Amersham 公司。DNA 分子量標準從Fermentas 公司購買。30%聚丙烯酰胺膠濃縮液購自Bio-Rad 公司。β-巰基乙醇(2-ME)，過硫酸銨，SDS，Tris，EDTA，TEMED 購自Sangon 公司。限制性內切酶，T4連接酶，異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Thermo Fisher公司；、氨芐青霉素、咪唑、還原型谷胱甘肽(GSH) 、氧化型谷胱甘肽(GSSG) 、二硫蘇糖醇( dithiothreitol，DTT)、 LB 培養(yǎng)基購自廈門泰京生物技術有限公司，尿素和鹽酸胍購自廣州金華大化學試劑公司;質粒提取試劑盒，核酸回收試劑盒購自Omega公司；純化填料購自GE公司；色譜柱Agilent Bio SEC-5和Agilent ZORBAX 300SB-C18購自Agilent公司；其它試劑均為分析純。凝膠成像分析系統(tǒng)購自(UVP 7300) UVP 公司；超純水制備裝置(HPLC/UF) 購自PALL 公司；微型臺式高速離心機(mini spin) 購自 Eppendorf 公司；臺式高速冷凍離心機(Allegra 64R) 購自Beckman 公司；電子分析天平 (METTLER AE 240) 購自Mettler 公司；SDS-PAGE 系統(tǒng)購自 Bio-Rad公司；酶標儀(Model 680) 購自Bio-Rad 公司；-80℃超低溫冰箱(Scientific Bio-freezer) 購自Forma 公司；紫外/可見分光光度計(ND-1000) 購自NanoDrop 公司；多用電泳儀(Power Pac 300) 購自Bio-Rad 公司；生物反應器為GE公司產品；蛋白純化系統(tǒng)為GE公司產品；MALDI串聯(lián)質譜儀為ABI公司產品；高效液相色譜儀(HPLC)1200 Series為Agilent公司產品。

1.2 人IL-15 蛋白分子結構的分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到人IL-15蛋白的氨基酸序列。同時可以從網站中找到IL-15 蛋白質三維結構和四級結構。

1.3 表達載體的構建

基于人IL-15蛋白氨基酸序列，根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子和核酸二級結構特點，我們設計了rhIL-15的cDNA序列，再在它們的5’端和3’端分別加入 BamHI和EcolI酶切位點。合成的基因片段插入pGH質粒中，使用BamHI和EcolI雙酶切，回收酶切產物并純化，使用T4連接酶將基因片段和同樣雙酶切的pET-15b質粒連接。將10μL連接產物轉化進入100μL DH5α感受態(tài)細胞，涂布于LB/Amp+平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落培養(yǎng)過夜，使用質粒提取試劑盒提取質粒，BamHI和EcolI雙酶切鑒定，篩選陽性克隆，對陽性克隆進行DNA測序驗證。

1.4 rhIL-15蛋白的發(fā)酵表達

經過測序驗證的質粒1μL轉化進入100μL BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于LB/Amp+平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落培養(yǎng)過夜，放大體積至250mL。將250mL菌液接入含2.5L LB/Amp+液體培養(yǎng)基的生物反應器中，37℃ 450rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長早中期(OD600約為2)，加入1mM IPTG誘導6h，8000rpm離心收集菌體。

1.5 包涵體制備

菌體用6M尿素溶解，8000rpm離心收集上清，用親和填料Chelating Sepharose FF純化。用30mM Tris Cl 10mM β-ME 6M尿素pH 7.8平衡和上樣，用350mM咪唑洗脫目的蛋白。

1.6 蛋白復性

在洗脫目的蛋白中加入GSH/GSSG，10℃緩慢攪拌復性48h。把復性蛋白液用20mM TrisCl 20mM NaCl pH 7.8稀釋復性48h。(復性緩沖液A: 1mmol /L EDTA、20mmol /L Tris-HCl、0.2mmol /L GSSG、2.0mmol /L GSH、150mmol /L L-精氨酸、2.0mmol/L DTT、0.02mol/L NaCl、80mL/L甘油、1 mol /L鹽酸胍，pH7.8; 復性緩沖液B : 1mmol /L EDTA、20mmol /L Tris-HCl、0.2mmol /L GSSG、2.0mmol /L GSH、0.2mol /L L-精氨酸、2.0mmol /L DTT、0.02mol /L NaCl、80mL/L甘油、0.2g/L NaN3，pH7.8)。

1.7 復性蛋白捕獲

透析蛋白液用親和填料Chelating Sepharose FF純化。用20mM Tris Cl 20mM NaCl pH7.8平衡和上樣，用350mM咪唑洗脫目的蛋白。

1.8 蛋白純化

蛋白液用離子交換填料Q Fast Flow純化，用20mM Tris Cl 20mM NaCl pH 7.8平衡和上樣，用0.8M NaCl洗脫目的蛋白。洗脫蛋白液用凝膠過濾填料Superdex 75純化，在相應出峰位置收集目的蛋白。

1.9 蛋白電泳鑒定

電泳純度測定使用SDS-PAGE，配制15%分離膠和5%濃縮膠，20mA恒流電泳，考染檢測。

1.10 HPLC純度檢測

使用排阻色譜柱: Agilent Bio SEC-5，流動相: 0.15M 磷酸鈉0.15M NaCl pH7.0，柱溫28℃，檢測波長220nm，流速1mL/min。使用反向色譜柱: Agilent ZORBAX 300SB-C18，流動相: A 0.1% TFA/H2O B 0.1% TFA/90%ACN/H2O，柱溫28℃，檢測波長260nm，流速1ml/min。

1.11 質譜檢測

采用MALDI串聯(lián)質譜儀，點樣靶為質譜普通靶，檢驗用水為超純水(電阻率不低于18.2MΩcm，制備當天使用)，基質為芥子酸(4-羥基-3,5-二甲氧基肉桂酸)，樣品中鹽含量低于50mM，待測成分濃度高于0.01mg/mL。

1.12 生物學活性測定

將標準品和樣品稀釋至預稀釋濃度，做16個濃度梯度檢測，每個濃度做3個重復實驗，同時做陰性對照和空白對照，陰性對照為稀釋培養(yǎng)液+細胞，空白對照為稀釋培養(yǎng)液+細胞重懸培養(yǎng)液。取生長狀態(tài)好的CTLL-2細胞，吹打分散，1500rpm離心棄培養(yǎng)液，采用細胞重懸培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)并調整適當?shù)募毎麘乙簼舛?，取出加入到加有標準品和樣品?6孔板中，37℃ 5% CO2培養(yǎng)18～24h。標準品/樣品/空白各孔加入MTT溶液，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)4～6h，再加入甲瓚裂解液吹打，酶標儀比色，檢測波長570 nm，參考波長630nm。

2 結果

2.1 重組表達載體的構建和鑒定

BamHI和EcolI雙酶切的rhIL-15基因片段回收純化，和同樣雙酶切的pET-15b質粒連接并轉化。挑取單菌落抽提質粒雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在350 bp處出現(xiàn)酶切片段，結果與預期一致，DNA測序也顯示序列正確。

2.2 rhIL-15合蛋白在大腸桿菌中的表達

含重組質粒pET-22b-rhIL-15的菌株經IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE，結果顯示在分子量約16kD處出現(xiàn)蛋白表達條帶。

2.3 rhIL-15蛋白的純化

取2mL預培養(yǎng)的的培養(yǎng)液到200mL新鮮的LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3～4h至A600為0.4～0.6時，加入濃度為0.5mmol/L 的誘導劑IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4～8h，收集誘導后的菌體。重懸，超聲破碎后離心得到重組IL-15蛋白包涵體。包涵體經洗滌緩沖液洗滌后，用6mol/L鹽酸胍和6mol/L尿素溶解。我們發(fā)現(xiàn)，重組IL-15蛋白包涵體不溶于6mol/L的尿素而溶于6mol/L的鹽酸胍，因此我們選擇6mol/L 的鹽酸胍溶解IL-15包涵體，進一步使用親和層析、離子交換層析和凝膠過濾進行精純，我們最終獲得rhIL-15目的蛋白。

2.4 rhIL-15蛋白的純度測定

使用排阻色譜柱和反向色譜柱檢測蛋白的純度，檢測結果顯示，rhIL-15蛋白排阻柱出峰時間為11.206min，純度為98%(圖1A)，反向柱出峰時間為13.093min，純度為96%(圖1B)。

圖1 rhIL-15蛋白HPLC色譜柱檢測A 排阻柱檢測 B 反向柱檢測

2.5 rhIL-15蛋白的分子量測定

使用MALDI串聯(lián)質譜儀測定rhIL-15蛋白的分子量。rhIL-15蛋白的分子量測定結果為12768.605Da(圖2)，與理論分子量基本一致。

圖2 rhIL-15蛋白質譜的分子量分析

2.6 rhIL-15蛋白的生物學活性

采用CTLL-2/MTT比色的方法測定rhIL-15蛋白的生物學活性。通過參數(shù)回歸計算測得，蛋白的比活性為5.86×108IU/mg。

3 討論

IL-15是新近發(fā)現(xiàn)的一種因子，在人體多種組織和細胞中廣泛分布，在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。IL-15可誘導B細胞，T細胞和NK細胞增殖；IL-15能夠刺激，誘導LAK細胞活性，還能與IL-12協(xié)同刺激NK細胞產生IFN-γ。IL-15不僅在自身免疫系統(tǒng)平衡中扮演重要角色，促進各種免疫細胞的活性及增殖，還在抗病毒感染、免疫治療、腫瘤基因治療、DNA疫苗等方面表現(xiàn)出巨大的臨床應用潛力[6～8]。

然而IL-15在人體組織中含量甚微，難以滿足日益增加的科研與臨床需求。因此簡單高效地獲得高純度高生物學活性的rhIL-15成為十分關鍵的步驟。迄今國內外有大量文獻闡述了rhIL-15蛋白的表達和純化[9,10]，但是卻很少出現(xiàn)有獲得與天然的人IL-15蛋白氨基酸序列完全一致的rhIL-15蛋白的報道，本文報道的制備rhIL-15蛋白的方法，采用大腸桿菌表達系統(tǒng)，通過基因工程手段簡單高效地獲得rhIL-15，并且讓復性后的蛋白獲得高生物活性。眾所周知，蛋白的功能與活性取決與其正確折疊的程度。研究表明人IL-15蛋白含有2對二硫鍵[11]，rhIL-15包涵體蛋白的復性因此顯得尤其重要。我們通過摸索復性過程中的不同鹽濃度、GSH/GSSG比例、表面活性劑添加條件和稀釋條件，得到了一個合適的蛋白復性條件。最終的生物學活性分析表明，制備的rhIL-15蛋白比活性較高，為蛋白的規(guī)?；a和進一步應用研究提供了堅實的基礎。

本實驗中利用高效液相色譜法和質譜法來檢測rhIL-15的純度和分子量。在摸索最佳條件中得出以下經驗：色譜柱類型及流動相的設置要根據(jù)待檢測樣品的理化特性，流動相的濃度要適當，如果濃度不足或過量，可能影響峰形，峰面積和分離度。 另外, 流動相pH值，柱溫，檢測波長，流速的選擇要注意結合實驗條件，遵循相應的標準，以確保檢測結果的精確性。而質譜儀測定時，樣品鹽濃度不宜過高，待測成分濃度不能過低，如有鹽濃度過高或是待測成分過低的情況可以采用超濾、使用相應萃取小柱等方法達到脫鹽和濃縮待測成分的目的。