適合奶醋發(fā)酵的酵母菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

姚妞妞，常春暉，于宏偉，郭潤(rùn)芳

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定，071000)

牛乳的主要營養(yǎng)成分為乳脂肪、乳蛋白、乳糖等，其中乳脂肪是主要的能量物質(zhì)，乳蛋白包含人體必需的8種氨基酸，乳糖能維持牛奶甜度，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收[1]。利用牛乳為原料的乳飲品種類較多，如酸乳飲料，它分為發(fā)酵型和配制型，前者營養(yǎng)成分高、風(fēng)味好[2]。發(fā)酵型奶醋作為一種新型飲品，國內(nèi)外對(duì)它的研究較少，據(jù)產(chǎn)品介紹恒順發(fā)酵型奶醋是利用了酵母菌、乳酸菌和醋酸菌經(jīng)過二次發(fā)酵制備而成，它既包含乳酸菌飲料的營養(yǎng)又包含醋飲料的保健功能。我國對(duì)于奶醋飲料的研究報(bào)道較多的是配制型奶醋的制備及功能，如李敏等[3]利用脫脂奶粉和鎮(zhèn)江白醋等為主要原料制作配制型奶醋飲料；再如管嫻月等[4]探究富硒輪梗霉與奶醋對(duì)小鼠降血脂和抗氧化作用的影響。但對(duì)于發(fā)酵型奶醋，僅發(fā)現(xiàn)我國恒順發(fā)酵型奶醋走高端市場(chǎng)的報(bào)道[5]，尚未有關(guān)于菌株及工藝相關(guān)研究的報(bào)道。

奶醋發(fā)酵與果醋發(fā)酵機(jī)理相同，涉及2個(gè)階段的微生物代謝過程，一是酵母菌利用糖在厭氧條件下發(fā)酵生成酒精，二是醋酸桿菌在有氧條件下將酒精氧化成醋。因此，優(yōu)良發(fā)酵菌株的選擇是制備發(fā)酵型奶醋的關(guān)鍵。據(jù)報(bào)道，乙醇是醋酸發(fā)酵的底物，并為醋酸菌的生長(zhǎng)代謝提供能量，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過4%時(shí)，醋酸菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制[6]。乙醇體積分?jǐn)?shù)超過10%時(shí)，抑制醋酸菌生長(zhǎng)，鈍化其氧化酒精的能力，引起乙醛積累[7]，故選擇酒精體積分?jǐn)?shù)不超過10%的酵母菌株，有利于維持奶醋發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性。研究乙醇發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的目的在于通過發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究來進(jìn)行最佳發(fā)酵工藝條件的控制[8]，因此酵母發(fā)酵動(dòng)力學(xué)對(duì)奶醋的開發(fā)有重要的指導(dǎo)意義。

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是將發(fā)酵過程中與菌體繁殖、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物生成等參數(shù)進(jìn)行定量分析，研究他們之間的動(dòng)態(tài)定量關(guān)系，更準(zhǔn)確地對(duì)參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，這對(duì)發(fā)酵過程有重要的指導(dǎo)意義[9]。引入數(shù)學(xué)模型整理實(shí)際發(fā)酵過程中得到的大量數(shù)據(jù)，并以簡(jiǎn)潔的形式進(jìn)行表達(dá)，可以更好地控制發(fā)酵過程，并可利用小試驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)大規(guī)模的發(fā)酵工藝過程[10-11]。常用Logistic方程[12]表達(dá)菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)；酵母菌體生長(zhǎng)與酒精生成屬于部分偶聯(lián)關(guān)系，一般用Leudeking-Piret方程[13]表達(dá)酒精生成動(dòng)力學(xué)；底物消耗用于菌體生長(zhǎng)和代謝生成產(chǎn)物的消耗，一般用Leudeking-Piret方程表達(dá)底物消耗動(dòng)力學(xué)。非線性擬合方法[14]是發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型較為經(jīng)典的算法之一，本研究將采用非線性擬合方法，建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程，這將有利于準(zhǔn)確的掌握以牛乳為原料的酵母發(fā)酵規(guī)律，了解發(fā)酵過程的各項(xiàng)指標(biāo)[15]，對(duì)下一步發(fā)酵奶醋有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

Saccharomycescerevisiae4-2，S.cerevisiae4-3，S.cerevisiae6-1，S.cerevisiae6-2，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏；安琪干酵母、安琪果酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

蔗糖，上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸，上海阿拉丁生化科技有限公司；苯酚，上海麥潤(rùn)爾化學(xué)技術(shù)有限公司；純牛奶，內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Synergy HTX型酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；TDZ5-WS型高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司；ZHWY-2102C型搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.4 菌株發(fā)酵條件

分別挑取斜面保存的2株酵母菌，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化，然后按照不同的接菌量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，并分別于不同溫度條件下培養(yǎng)，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)，以活菌數(shù)為衡量指標(biāo)，確定了最適接菌量為2%，最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

分別挑取S.cerevisiae4-2和安琪干酵母斜面保存的菌種，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12 h活化后，分別吸取發(fā)酵液體積2%的活化后的2株酵母菌，接種于添加蔗糖質(zhì)量濃度分別為0、50、100、150 g/L的純牛奶中，密閉培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，每間隔8 h取1次發(fā)酵樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 感官評(píng)價(jià)

參考文獻(xiàn)[3]中對(duì)配制型奶醋的感官要求，制定出感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。選定8名相關(guān)專業(yè)人員作為評(píng)定員(從事于食品工程、食品營養(yǎng)與分析、食品質(zhì)量與安全專業(yè))。發(fā)酵24 h后，分別取一定量的各組樣品進(jìn)行感官評(píng)定。所評(píng)定的感官指標(biāo)為色澤、口感、組織狀態(tài)和風(fēng)味，如表1所示。

表1 酵母菌感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Yeast sensory scoring criteria

1.5.2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

硫酸苯酚法[16]測(cè)可溶性總糖含量。取0.5 mL發(fā)酵液，加入1 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))的三氯乙酸對(duì)發(fā)酵液中的各類蛋白進(jìn)行沉淀，再離心取上清液對(duì)其進(jìn)行稀釋。取1 mL的稀釋液，加入500 μL 9%(體積分?jǐn)?shù))的苯酚溶液，搖勻，再加入2.5 mL的濃H2SO4。比色液總體積為4 mL，在室溫下放置30 min，顯色。在485 nm處測(cè)得吸光值。

硫酸苯酚法測(cè)定不同濃度梯度的糖含量的變化與OD值之間的關(guān)系，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.013 2x+0.032 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，線性相關(guān)性良好，可以直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得樣品糖的濃度。

1.5.3 酵母發(fā)酵時(shí)菌落數(shù)的測(cè)定

純牛奶經(jīng)發(fā)酵后測(cè)其活菌數(shù)，發(fā)酵至相應(yīng)的時(shí)間時(shí)，將發(fā)酵液進(jìn)行10倍梯度稀釋選取適宜的濃度后吸取1 mL，采用傾注法使其于溫度適宜的固體YPD培養(yǎng)基混勻，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[17]。

1.5.4 底物殘?zhí)堑臏y(cè)定

方法同總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，采用硫酸苯酚法。

1.5.5 酒精度的測(cè)定

參考GB/T 23546—2009中對(duì)酒精測(cè)定的方法[18]，并稍加改進(jìn)。取10 mL試樣與10 mL蒸餾水于蒸餾瓶中，加熱蒸餾，餾出液體積約9.5 mL時(shí)停止蒸餾，于水浴冷卻至20 ℃時(shí)，測(cè)定溫度和酒精度，并換算單位20 ℃時(shí)的酒精度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的篩選

各菌株發(fā)酵牛乳后的感官評(píng)價(jià)結(jié)果如表2所示。

表2 感官分析分值與產(chǎn)乙醇量Table 2 Sensory analysis scores and ethanol production

由表2可知，S.cerevisiae4-2和安琪干酵母的感官評(píng)分最高，分別為93.5分和95.5分，故選取S.cerevisiae4-2和安琪干酵母作為本試驗(yàn)研究的菌株。

2.2 酵母菌發(fā)酵過程中的物質(zhì)變化

使用不同初始蔗糖質(zhì)量濃度(0、50、100、150 g/L)的純牛奶發(fā)酵，在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定酵母菌發(fā)酵過程中的物質(zhì)變化。

2.2.1 發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)變化

菌體生長(zhǎng)變化結(jié)果如圖1所示。在發(fā)酵過程中，2株酵母菌的菌體生長(zhǎng)整體趨勢(shì)均先增高后趨于平穩(wěn)，且在發(fā)酵24 h達(dá)到最大值。質(zhì)量濃度為50 g/L以上的蔗糖在穩(wěn)定期菌量差異不顯著，均穩(wěn)定在108CFU/mL。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖1 不同蔗糖添加量的牛奶中菌體生長(zhǎng)變化Fig.1 Changes of bacterial growth in milk with different sucrose additions

2.2.2 底物蔗糖的消耗

底物糖的變化結(jié)果如圖2所示。在發(fā)酵過程中，2株酵母菌的底物糖的消耗均整體逐漸降低。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖2 不同蔗糖添加量的牛奶中底物蔗糖含量的變化Fig.2 Changes of sucrose content in the substrate of milk with different sucrose additions

2.2.3 產(chǎn)物酒精的生成

由圖6可見，建立的雷公藤一致性模型可準(zhǔn)確地驗(yàn)證被測(cè)藥材是否為雷公藤，包括雷公藤的地方習(xí)用品昆明山海棠（驗(yàn)證集D）也能夠以較高的最大CI值（大部分最大CI值＞30.0）與雷公藤作出區(qū)分。

產(chǎn)物酒精含量的變化結(jié)果如圖3所示。在發(fā)酵過程中，2株酵母菌產(chǎn)物酒精的含量總體均呈上升趨勢(shì)，先緩慢增長(zhǎng)再快速增長(zhǎng)，最后趨于平穩(wěn)。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖3 不同蔗糖添加量的牛奶中產(chǎn)物酒精含量的變化Fig.3 Changes of alcohol content in milk with different sucrose additions

2.3 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

2.3.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

描述菌體生長(zhǎng)最常用的是Monod模型，它是基于3個(gè)假設(shè)建立的。一是菌體生長(zhǎng)為均衡型，即菌體生長(zhǎng)的唯一變量是菌體濃度；二是培養(yǎng)基中只有一種底物是限制性因素，其他營養(yǎng)成分不影響菌體生長(zhǎng)；三是菌體的生長(zhǎng)視為單一反應(yīng)，細(xì)胞得率是常數(shù)。但Monod方程只適合細(xì)胞生長(zhǎng)較慢、細(xì)胞密度較低且無抑制作用的環(huán)境下。這不適合應(yīng)用于酵母乙醇發(fā)酵過程，較為普遍采用Logistic方程。在純牛奶酒精發(fā)酵過程中，采用平板計(jì)數(shù)的方法測(cè)定的酵母菌生長(zhǎng)趨勢(shì)變化規(guī)律遵循典型的“S”型曲線[20]，因此可用Logistic方程描述菌體生長(zhǎng)的變化規(guī)律，該方程能較好的反映發(fā)酵過程中由于菌體濃度的增加對(duì)其自身生長(zhǎng)繁殖所產(chǎn)生的抑制效應(yīng)[21-23]。該方程如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

對(duì)公式(1)積分得：

(2)

式中：X0,初始菌體量；Xm,最大菌體量；μm,最大比生長(zhǎng)速率。

用非線性曲線擬合的Logistic方程對(duì)2株酵母菌體生長(zhǎng)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，圖4為酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。酵母菌體動(dòng)力學(xué)擬合的相關(guān)參數(shù)如表3所示。

a-S.cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖4 不同初始蔗糖濃度的菌體生長(zhǎng)實(shí)測(cè)值與擬合曲線Fig.4 Measured values and fitted curves of bacterial growth at different initial sucrose concentrations

如圖4所示，0～24 h時(shí)2株酵母菌菌體均快速增長(zhǎng)，至進(jìn)入穩(wěn)定期酵母菌量都基本維持不變。由表3可知，擬合的R2>0.950，說明擬合度較好。

表3 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母酒精發(fā)酵酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Growth kinetic parameters of S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast alcohol fermentation yeast

2.3.2 底物蔗糖消耗動(dòng)力學(xué)模型

底物蔗糖的消耗包括了用于菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物代謝方面的消耗，包括了3個(gè)方面：一是用于菌體生長(zhǎng)的消耗，以合成新酵母；二是酵母維持基本生命活動(dòng)的消耗；三是用于產(chǎn)物生成的消耗。根據(jù)底物消耗物料衡算，可以得到底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型，一般用Leudeking-Piret模型表示[24]，如公式(3)、公式(4)所示：

(3)

對(duì)公式(3)積分得：

(4)

式中：Yx/s，菌體對(duì)底物的得率系數(shù)；ms酵母代謝的維持系數(shù)。

將菌體生長(zhǎng)的Logistic方程公式(2)以及菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)分別代入公式(4)，即可求得底物消耗動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線。底物蔗糖消耗的擬合曲線如圖5所示。底物蔗糖消耗動(dòng)力學(xué)擬合的相關(guān)參數(shù)如表4所示。

表4 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母發(fā)酵時(shí)底物蔗糖消耗的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of substrate sucrose consumption during fermentation of S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖5 不同初始蔗糖濃度的底物蔗糖消耗的實(shí)測(cè)值與擬合曲線Fig.5 Measured values and fitting curves of substrate sucrose consumption at different initial sucrose concentrations

如圖5所示，2株酵母菌在發(fā)酵的56 h內(nèi)，隨著時(shí)間的變化，底物蔗糖的濃度逐漸減小，56 h時(shí)達(dá)到最小值。由表4可知，擬合的R2>0.950，說明擬合度較好。

2.3.3 酒精生成動(dòng)力學(xué)模型

在酒精發(fā)酵過程中，根據(jù)菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)，分為3類：偶聯(lián)型、部分偶聯(lián)型和混合型。由于酵母的生長(zhǎng)伴隨著酒精的生成，酒精的生成過程與酵母的生長(zhǎng)關(guān)系被看作是生長(zhǎng)偶聯(lián)型，最常用的模型Leudeking-Piret方程來描述酒精生成與酵母菌體數(shù)量的關(guān)系。方程如公式(5)、公式(6)所示：

(5)

式中：α為生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù)；β為非生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù)。

當(dāng)公式(5)α≠0且β=0時(shí)為偶聯(lián)型；當(dāng)公式(5)α=0且β≠0時(shí)為部分偶聯(lián)型；當(dāng)公式(5)α≠0且β≠0時(shí)為混合型。

對(duì)公式(5)積分得：

(6)

將菌體生長(zhǎng)的Logistic方程公式(2)以及菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)分別代入公式(6)，即可求得產(chǎn)物酒精生成動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線。圖6為產(chǎn)物酒精生成的擬合曲線。產(chǎn)物酒精生成動(dòng)力學(xué)擬合的相關(guān)參數(shù)如表5所示。

a-S. cerevisiae 4-2;b-安琪干酵母圖6 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母酒精發(fā)酵產(chǎn)酒精動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.6 Kinetic parameters of alcohol production by S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast

如圖6所示，0～24 h時(shí)，2株酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物酒精的含量總體均呈上升趨勢(shì)，先緩慢增長(zhǎng)再快速增長(zhǎng)，最后趨于平穩(wěn)。由表5可知，擬合的R2>0.950，說明擬合度較好。

表5 S. cerevisiae 4-2和安琪干酵母發(fā)酵產(chǎn)物酒精生成的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 5 Kinetic parameters of alcohol production from fermentation products of S. cerevisiae 4-2 and Angel dry yeast

綜上，考慮到菌體生長(zhǎng)、底物糖的消耗、酒精的生成情況，不同初始蔗糖質(zhì)量的牛乳中，達(dá)到最大菌體量穩(wěn)定期的時(shí)間基本相同，底物蔗糖的消耗基本一致；考慮生成的奶醋發(fā)酵的酒精量時(shí)，S.cerevisiae4-2的100 g/L初始蔗糖質(zhì)量濃度和安琪干酵母的150 g/L初始蔗糖質(zhì)量濃度較為合適?，F(xiàn)數(shù)據(jù)經(jīng)軟件處理，選用自定義參數(shù)擬合，經(jīng)過非線性擬合后獲得各個(gè)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)，將其模型參數(shù)代入動(dòng)力學(xué)模型中，得動(dòng)力學(xué)模型方程，匯總?cè)绫?。

表6 發(fā)酵過程擬合方程及其相關(guān)系數(shù)Table 6 Fitting equation of fermentation process and its correlation coefficient

2.4 模型驗(yàn)證

由表7可知，S.cerevisiae4-2和安琪干酵母3個(gè)模型的理論值和試驗(yàn)值的誤差大部分<10%，S.cerevisiae4-2的3個(gè)模型理論值和試驗(yàn)值的誤差的平均值分別為6.61%、8.12%、6.51%，安琪干酵母的3個(gè)模型理論值和試驗(yàn)值的誤差的平均值分別為6.05%、7.37%、5.95%，說明模型擬合較好。

3 結(jié)論

本研究通過感官評(píng)價(jià)篩選出適合奶醋發(fā)酵的釀酒酵母(S.cerevisiae)4-2和安琪高活性干酵母，其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)表明S.cerevisiae4-2的100 g/L初始蔗糖質(zhì)量濃度和安琪干酵母的150 g/L初始蔗糖質(zhì)量濃度在不同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)生乙醇的體積分?jǐn)?shù)都在10%以下，符合奶醋發(fā)酵的要求。

表7 模型理論值和試驗(yàn)值的比較Table 7 Comparison of theoretical values of the model and the laboratory

以蔗糖為底物的動(dòng)力學(xué)模型，無論是菌體生長(zhǎng)模型、底物消耗模型還是酒精生成模型，擬合度均較好，且2株酵母菌的3個(gè)模型的理論值和試驗(yàn)值的誤差大部分<10%。因此，建立的理論模型可以較好的預(yù)測(cè)奶醋的發(fā)酵過程，從而進(jìn)一步掌握酵母發(fā)酵牛乳過程中物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為最佳發(fā)酵工藝條件的控制提供理論基礎(chǔ)，對(duì)奶醋的制備有重要的指導(dǎo)意義。

另外，本研究也有需要改進(jìn)的地方，例如，發(fā)酵初期并未完全做到無氧發(fā)酵，也并未考慮底物蔗糖的濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用等。所以，未來的動(dòng)力學(xué)研究應(yīng)盡可能完善無氧發(fā)酵條件，底物和產(chǎn)物的抑制作用等，這將對(duì)進(jìn)一步掌握發(fā)酵過程發(fā)揮很大的作用。