不同酵母對(duì)桑葚酒品質(zhì)的影響及菌株篩選

孔燕，秦凡平，覃俊，龔馨，廖麗，姜林君，陳安均

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625000)

桑葚又名桑椹、桑棗等，為桑樹所結(jié)的聚合型多肉漿果[1]。桑葚風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富[2]，但鮮果在室溫下極不耐貯藏，易變味、腐爛[3]。用桑葚釀造桑葚酒，可解決桑葚不耐貯藏的問題。桑葚酒是以新鮮桑葚或桑葚汁為原料，利用酵母將糖轉(zhuǎn)化為酒精等產(chǎn)物得到的果酒產(chǎn)品[4]。

釀酒酵母是果酒釀造成敗及品質(zhì)好壞的一個(gè)關(guān)鍵因素[5]。OUYANG等[6]、劉瑋等[7]研究了酵母種類對(duì)桑葚酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響；史清龍[8]、TAO等[3]研究了不同酵母對(duì)桑葚酒感官品質(zhì)的影響；顏雪輝[9]對(duì)桑葚酒專用酵母進(jìn)行了選育；TCHABO等[10]研究了酵母接種量對(duì)桑葚酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響；LIU等[11]研究了酵母菌株對(duì)桑葚酒抗氧化活性的影響；張晶等[4]研究了酵母接種量對(duì)桑葚酒中揮發(fā)酸的影響。但尚未開展釀制低揮發(fā)酸桑葚酒的菌株篩選研究。

本實(shí)驗(yàn)選擇5株產(chǎn)揮發(fā)酸較低的商業(yè)酵母(AC、F33、F15、FX10和2323)和5株常見的商業(yè)酵母(RC212、D254、71B、KD和Top15)釀制桑葚酒，主要分析不同酵母對(duì)桑葚酒揮發(fā)酸的影響，并結(jié)合揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和感官評(píng)價(jià)，采用模糊綜合評(píng)判模型，選出1株最適宜發(fā)酵桑葚酒的酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚(云桑2號(hào))，采摘自四川省鹽邊縣；F15、F33、FX10、AC酵母，法國拉氟德公司；2323、D254、RC212、71B酵母，法國拉曼公司；Top15酵母，意大利英納帝斯公司；KD酵母，法國馬丁威蘭特公司(酵母均為市售產(chǎn)品)。

焦亞硫酸鉀(食品級(jí))，一諾生物科技有限公司；葡萄糖等(分析純)、乙酸正丁酯等(色譜純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；叔戊醇(標(biāo)準(zhǔn)品)，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1 μL微量進(jìn)樣器(W-3型)，上海安亭微量進(jìn)樣器廠；50/30UM DVB/CAR on PDMS萃取頭、固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣手柄，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氣相色譜儀(7890B型)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A/59750型)，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桑葚酒的釀制

桑葚清洗后壓榨取汁，加80 mg/kg SO2，室溫密封放置3 h，加蔗糖調(diào)整糖度為21 °Brix，按桑葚汁質(zhì)量的0.03%添加酵母，20 ℃發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，倒灌除去酒腳，加40 mg/kg SO2， 20 ℃陳釀30 d。

1.3.2 基礎(chǔ)指標(biāo)的測(cè)定

酒精度按GB 5009.225—2016[16]的方法測(cè)定；干浸出物、總糖、還原糖、總酸、揮發(fā)酸，按GB/T 15038—2006[17]的方法測(cè)定；甲醇按GB 5009. 266—2016[18]的方法測(cè)定；可溶性固形物(total soluble solid，TSS)用手持糖度計(jì)測(cè)定；pH用酸度計(jì)測(cè)定。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

參照XIAO等[19]、蔣成[20]的方法，采用頂空固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)測(cè)定桑葚酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

內(nèi)標(biāo)物配制和酒樣處理：用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇配制含1 770 mg/L乙酸正丁酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取50 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用酒樣定容，得到含8.85 mg/L乙酸正丁酯的待測(cè)酒樣。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取操作：向含1 g NaCl的頂空瓶中加4 mL待測(cè)酒樣，把頂空瓶放入50 ℃恒溫水浴鍋中平衡10 min后，將固相微萃取頭插入頂空瓶內(nèi)萃取40 min，萃取完成后，再于GC進(jìn)樣口解析5 min。

GC條件：HP-5MS色譜柱30 m×0.250 mm，初始溫度40 ℃，保持時(shí)間5 min，以10 ℃/min升至70 ℃，再以3 ℃/min升至140 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度260 ℃。

MS條件：電離方式EI，電離電壓70 eV，燈絲流量0.25 mA，連接桿溫度280 ℃，電子倍增器電壓1 500 V，掃描范圍30～350 mAU，離子源溫度250 ℃。

定性分析：通過檢索工作站自帶的NIST11標(biāo)準(zhǔn)譜庫定性，選擇匹配度≥70%的物質(zhì)為有效物質(zhì)。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，計(jì)算如公式(1)所示:

待測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)濃度

(1)

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

參照GB/T 15038—2006[17]和胡永正[21]的方法，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院18名具有專業(yè)知識(shí)的人員，對(duì)陳釀30 d后的桑葚酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)及權(quán)重如表1所示。

表1 桑葚酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of mulberry wine

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±SD(n=3)，采用IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用origin 2018軟件作圖，相關(guān)性分析采用相關(guān)系數(shù)法，顯著性界值為P<0.05，極顯著性界值為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母對(duì)桑葚酒基礎(chǔ)指標(biāo)的影響

10株酵母發(fā)酵桑葚酒的基礎(chǔ)指標(biāo)如表2所示。不同酵母代謝存在差異[22]，發(fā)酵酒的指標(biāo)也有所不同。D254和FX10發(fā)酵酒酒精度最高，為10.52 vol%和10.45 vol%，RC212和KD發(fā)酵酒酒精度最低，為9.46 vol%和9.75 vol%。RC212和KD發(fā)酵酒干浸出物含量和TSS最高。71B和Top15發(fā)酵酒總糖含量最高，為3.03和2.99 g/L，這2株菌發(fā)酵酒酒精度為10.03 vol%和10.06 vol%，除RC212和KD外，低于其他6株菌。Top15和F15發(fā)酵酒還原糖含量最高，為2.68和2.58 g/L。RC212和KD發(fā)酵酒總酸含量最高，為9.81和9.06 g/L，這2株菌發(fā)酵酒的pH值也最低，均為4.11。NY/T 1508—2017[23]規(guī)定，果酒中總酸質(zhì)量濃度為4.00～9.00 g/L(以酒石酸計(jì))，RC212和KD發(fā)酵酒總酸含量超過了限量標(biāo)準(zhǔn)。RC212、KD、Top15和71B發(fā)酵酒揮發(fā)酸含量最高，分別為1.94、1.86、1.45和1.42 g/L，高于GB 15037—2006[13]規(guī)定的揮發(fā)酸限量。10株菌發(fā)酵酒甲醇含量均小于國家限量標(biāo)準(zhǔn)400 mg/L[13]。

表2 不同酵母發(fā)酵桑葚酒的基礎(chǔ)指標(biāo)Table 2 Basic indexes of mulberry wine by different yeast strains fermented

2.2 不同酵母對(duì)桑葚酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

RC212和KD發(fā)酵酒總酸和揮發(fā)酸含量、Top15和71B發(fā)酵酒揮發(fā)酸含量均不符合果酒限量標(biāo)準(zhǔn)，故這4株菌不適合釀制桑葚酒，不進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析。

由表3可知，2323、AC、FX10、F15、D254和F33發(fā)酵酒中共檢出44種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中，酯類23種，醇類5種，醛類1種，酮類2種，酚類9種，其他類4種，種類排序?yàn)锳C(29種)= F33(29種)>F15(28種)>2323(27種)>FX10(25種)=D254(25種)。6株菌發(fā)酵酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量濃度為46 167.98～70 302.36 μg/L，酯類24 859.03～33 102.50 μg/L，醇類18 603.67～38 459.34 μg/L，醛類192.39～357.99 μg/L，酮類0～32.57 μg/L，酚類1 919.33～2 925.15 μg/L，其他類464.44～2 198.39 μg/L，總量排序?yàn)?323(70 302.36 μg/L)>D254(66 509.25 μg/L)>F15(63 863.25 μg/L)>F33(58 677.77 μg/L)>FX10(51 294.19 μg/L)>AC(46 167.98 μg/L)。

2.2.1 酯類物質(zhì)比較

酯類是發(fā)酵酒揮發(fā)性成分的重要組成部分，也是構(gòu)成香氣骨架的關(guān)鍵成分[24]，可賦予果酒濃郁的水果香[25]。2323、AC、FX10、F15、D254和F33發(fā)酵酒酯類含量分別為27 661.31、24 859.03、28 001.02、25 482.8、33 102.5和28 775.67 μg/L，占各自發(fā)酵酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量的39.35%、53.84%、54.59%、39.90%、49.77%和49.04%，D254和F33發(fā)酵酒酯類含量最高，但AC和FX10占比最大。6株菌發(fā)酵酒中共有的酯類有11種。所有酯類中辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯含量較高，且6種酒樣均有這4種物質(zhì)。辛酸乙酯可賦予果酒花香、香蕉味、梨味和白蘭地味[26]；丁二酸二乙酯具有蘋果香，酒香和舒適的花香[27]；癸酸乙酯具有脂肪味，舒適的醋味和果香[28]；正己酸乙酯具有蠟香、脂肪香和青草香[27]。劉琦[25]研究了BV818、EC1118、LA-FR和SY 四種酵母對(duì)貴人香干白葡萄酒香氣的影響，發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯和正己酸乙酯含量在酯類中較高，與本研究相似。

表3 不同酵母發(fā)酵酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 3 Volatile flavor compounds of mulberry wine by different yeast strains fermented

續(xù)表3

2.2.2 醇類物質(zhì)比較

醇類主要是酒精發(fā)酵過程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物[36]。2323、AC、FX10、F15、D254和F33發(fā)酵酒醇類質(zhì)量濃度分別為38 459.34、18 603.67、18 726.34、35 085.71、29 051.53和27 025.58 μg/L，占各自發(fā)酵酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量的54.71%、40.30%、36.51%、54.94%、43.68%和46.06%，2323和F15發(fā)酵酒醇類含量最高，占比也最大。苯甲醇、苯乙醇和芳樟醇是6個(gè)酒樣中共有的醇類，這3種醇的含量也最高。苯甲醇有苦杏仁味[27]，苯乙醇有玫瑰花和蜂蜜香[26]，芳樟醇可賦予果酒花香、青草味和柑橘香[20]。香茅醇是AC、F15和F33發(fā)酵酒特有醇類；1-辛醇是AC、FX10和F33發(fā)酵酒特有醇類。孫玉霞等[37]研究了D254、EC1118、D21、K1、DV10和 BM4×4六種酵母對(duì)桑葚酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)苯乙醇含量較高，與本研究相似，其還檢出正丙醇、異丁醇、異戊醇和十二醇等，本研究未檢出。

2.2.3 醛酮類、酚類及其他類比較

2323、AC、FX10、F15、D254和F33發(fā)酵酒中醛酮類、酚類及其他類物質(zhì)的總質(zhì)量濃度分別為4 181.71、2 705.28、4 566.83、3 295.14、4 355.22和2 876.52 μg/L，占各自發(fā)酵酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量的5.95%、5.86%、8.90%、5.16%、6.55%和4.90%。6個(gè)酒樣共有的物質(zhì)為苯甲醛和甲氧基苯基肟，苯甲醛有特殊的杏仁氣味[34]，甲氧基苯基肟的風(fēng)味描述未見報(bào)道。2323、AC、D254和F33發(fā)酵酒中丁香酚、2,4-二叔丁基苯酚和甲氧基苯基肟含量均較高，丁香酚有強(qiáng)烈的丁香香氣和溫和的辛香香氣[35]，2,4-二叔丁基苯酚的風(fēng)味描述也未見報(bào)道；FX10發(fā)酵酒中含量較高的是丁香酚和甲氧基苯基肟；F15發(fā)酵酒中含量較高的是2,4-二叔丁基苯酚和甲氧基苯基肟。

2.3 感官評(píng)價(jià)

6株菌發(fā)酵酒的感官得分情況如表4所示。不同酵母發(fā)酵酒外觀、滋味和典型性差異均不顯著(P<0.05)； 2323、AC、FX10、D254之間香氣差異不顯著，但與F15和F33差異顯著(P<0.05)。綜合得分為FX10>2323>F15>D254>AC>F33，2323、AC、FX10、F15和D254之間綜合得分差異不顯著，但與F33差異顯著(P<0.05)。

表4 感官評(píng)價(jià)得分情況 單位:分

2.4 相關(guān)性分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量與桑葚酒感官得分的相關(guān)性如圖1所示，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量與外觀和典型性相關(guān)性不大；乙酸芐酯、乙基9-癸烯酸酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、DL-白氨酸乙酯、香茅醇、2-甲氧基-5-丙-2-烯基苯酚、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、3-甲基-4-異丙基苯酚含量與香氣相關(guān)性較大，其中，前4種物質(zhì)與香氣呈正相關(guān)，與后5種呈負(fù)相關(guān)，DL-白氨酸乙酯與香氣呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚與香氣呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。苯甲醇、3-苯丙酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇、2,4-二叔丁基苯酚含量與滋味相關(guān)性較大，且呈正相關(guān)，與滋味呈負(fù)相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)矩陣顏色均較淺。月桂酸乙酯、癸酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、3-甲基-4-異丙基苯酚、DL-白氨酸乙酯含量與感官綜合得分相關(guān)性較大，其中，前4種物質(zhì)與感官綜合得分呈正相關(guān)，后3種呈負(fù)相關(guān)。

圖1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與感官得分的相關(guān)性熱圖Fig.1 The heat map of correlation of volatile flavor substances and sensory evaluation scores注：矩陣中紅色、藍(lán)色和白色分別代表正相關(guān)、負(fù)相關(guān)和不相關(guān)，顏色越深相關(guān)性越大?！?”表示相關(guān)性顯著(P<0.05)；“**”表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)

2.5 模糊綜合評(píng)判

單一指標(biāo)的高低不能完全反映桑葚酒品質(zhì)的好壞，因此考慮揮發(fā)酸含量、感官綜合得分及與感官綜合得分呈正相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量，采用模糊綜合評(píng)判模型篩選最適合發(fā)酵桑葚酒的酵母。

2323、AC、FX10、F15、D254和F33發(fā)酵酒中與感官綜合得分呈正相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量濃度為68 809.26、44 954.90、48 845.03、60 956.99、65 390.20和55 889.53 μg/L。

(1)建立判別對(duì)象集

U={U1,U2,U3,U4,U5,U6}，U1、U2、U3、U4、U5和U6分別代表2323、AC、FX10、F15、D254和F33釀制酒樣。

(2)建立評(píng)判因素集

X={X1,X2,X3}，X1,揮發(fā)酸含量；X2,感官綜合得分；X3,與感官綜合得分呈正相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。

(3)建立評(píng)判因素集

根據(jù)表2構(gòu)造揮發(fā)酸因素函數(shù)，如公式(2)所示：

(2)

根據(jù)表4構(gòu)造感官得分因素函數(shù)，如公式(3)所示：

(3)

與感官得分呈正相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可構(gòu)造線形上升函數(shù),如公式(4)所示：

(4)

(4)建立權(quán)重集

(5)模糊綜合評(píng)判計(jì)算

對(duì)每一因素利用U(Xi)模糊化，得到模糊關(guān)系矩陣；再用模糊線性變換，得到評(píng)判結(jié)果，歸一化得：

B=[0.208 1 0.092 1 0.120 5 0.221 8 0.194 3 0.163 2]

模糊綜合評(píng)判結(jié)果可表明酒樣綜合質(zhì)量的優(yōu)劣，從模型結(jié)果可得出不同酵母發(fā)酵桑葚酒的綜合質(zhì)量順序?yàn)镕15>2323>D254>F33>FX10>AC， F15最適合釀制桑葚酒。

3 結(jié)論

比較了2323、AC、FX10、71B、F15、D254、RC212、Top15、F33和KD 10株酵母發(fā)酵桑葚酒的揮發(fā)酸含量，只有2323、AC、FX10、F15、D254和F33六株酵母發(fā)酵酒揮發(fā)酸含量低于果酒限量標(biāo)準(zhǔn)(1.2 g/L，以乙酸計(jì))。采用GC-MS分析了這6株菌發(fā)酵酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，從物質(zhì)總種類排序?yàn)锳C=F33>F15>2323>FX10=D254，從物質(zhì)總含量排序?yàn)?323>D254>F15>F33>FX10>AC。對(duì)6株菌發(fā)酵酒做了感官評(píng)價(jià)，感官綜合得分為FX10>2323>F15>D254>AC>F33。對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量和感官綜合得分做了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量與感官綜合得分相關(guān)但不顯著，其中，30種物質(zhì)含量與感官綜合得分呈正相關(guān)，14種呈負(fù)相關(guān)。綜合考慮揮發(fā)酸含量、感官綜合得分和與感官綜合得分呈正相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量，采用模糊綜合評(píng)判方法，最終模型結(jié)果顯示不同酵母發(fā)酵桑葚酒的綜合質(zhì)量順序?yàn)镕15>2323>D254>F33>FX10>AC，酵母F15最適合釀制桑葚酒。