解淀粉芽孢桿菌DMBA-K4高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化及其抗氧化活性研究

鄺嘉華，黃燕燕，胡金雙，余佳佳，周欽育，趙珊，劉冬梅

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510640)

胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)是微生物分泌到細胞外的高分子碳水化合物，它在微生物抵抗環(huán)境壓力(滲透壓、干燥、有毒化合物和噬菌體)時發(fā)揮重要的作用[1]。

新型天然產(chǎn)物具有獨特的生化潛力，多糖作為典型的天然產(chǎn)物代表，備受關(guān)注。自然界中的多糖主要從植物和微生物中提取。微生物多糖具有易提取、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)影響的特點[2]，因此，與植物多糖相比，它被更廣泛應(yīng)用于食品添加劑、黏合劑和廢水處理等[3]。此外，EPS還具有良好的抗氧化性[4]、抗腫瘤[5]和免疫調(diào)節(jié)作用[6]。張玲秀等[7]對枯草芽孢桿菌EPS進行了免疫活性研究，結(jié)果表明其提高了小鼠的多項免疫指標；王輯等[8]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌JLK0142的EPS能作用于小鼠的RAW264.7巨噬細胞，并提高小鼠的免疫能力。解淀粉芽孢桿菌廣泛存在于自然界中，是一種公認安全的菌株[9]。目前對其研究較少并主要集中于抗菌肽[10-11]和酶制劑[12-13]等，關(guān)于EPS的報道較少。

已有眾多學(xué)者對源于乳酸菌的EPS進行研究[3,5-6]，對解淀粉芽孢桿菌的EPS研究可以豐富人們對新型微生物多糖的認識，擴寬其市場應(yīng)用前景。而發(fā)酵提取工藝是進行深入功能研究的基礎(chǔ)，高效且經(jīng)濟的發(fā)酵條件對拓展EPS的應(yīng)用領(lǐng)域具有現(xiàn)實意義。

本研究基于1株從云南普洱茶中分離純化得到的菌株DMBA-K4，16S rDNA鑒定其為解淀粉芽孢桿菌。針對其產(chǎn)EPS的特點，應(yīng)用單因素法和響應(yīng)面法對該菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期提高積累EPS效率。測定EPS體外抗氧化性，為進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株DMBA-K4,由實驗室從云南普洱茶中分離純化并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 60 644。

優(yōu)化材料：LB培養(yǎng)基、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露糖、牛肉膏、胰蛋白胨、酵母提取粉、NaCl，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；多糖提取純化及測定材料：濃H2SO4、苯酚、95%乙醇、正丁醇、氯仿，廣州卯林試劑有限公司；抗氧化性測定材料：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、抗壞血酸、FeSO4、無水乙醇、FeCl3、三氯乙酸、K3[Fe(CN)6]、K2HPO4、KH2PO4、水楊酸、30%H2O2，阿拉丁試劑(上海)有限公司，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ超凈工作臺，蘇州凈化；ZWY-100D溫控回旋臺式振蕩器，智誠；WH-861旋渦振蕩器，華利達設(shè)備有限公司；CPA225D分析天平，Sartorius；FC/K3/GO酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；5804R高速冷凍離心機，Eppendorf；PHB-5電子pH計，上海偉業(yè)儀器廠；YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊；-80 ℃低溫冰箱，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；透析袋(8 000～14 000 Da)，北京生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 16S rDNA菌種分子生物學(xué)鑒定

分離純化后的菌種樣品由基迪奧生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果與Gen Bank中已知菌種的相對序列進行比對，利用MEGA 6.0軟件將實驗菌株與選取的序列相似性較高的菌株序列進行對比分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 菌株活化

將DMBA-K4的斜面保種置于LB培養(yǎng)基中分別進行2次活化后得到種子發(fā)酵液，該種子發(fā)酵液的菌含量為108～109CFU/mL；將上述種子發(fā)酵液按體積比4∶100接入擴大培養(yǎng)基中，搖床上以30 ℃、180 r/min的條件培養(yǎng)12 h，得到DMBA-K4發(fā)酵液。

1.3.3 胞外多糖的提取

上述發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min離心15 min，除去沉淀菌體，保留上清液；向上清液加入3倍體積的95%乙醇，4 ℃靜置24 h，然后離心15 min，傾去上清液，沉淀用適量蒸餾水溶解后，置于透析袋中4 ℃透析24 h；向透析所得的液體中加入25%體積分數(shù)的sevage試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]，室溫下置于搖床振蕩30 min，使蛋白吸附在有機相中，然后8 000 r/min 離心1 min，保留水相。重復(fù)4～5次，直至蛋白完全除去，凍干保存。

1.3.4 胞外多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定DMBA-K4發(fā)酵液的EPS含量。移取透析后的樣品溶液200 μL于潔凈試管中，加入100 μL 5%苯酚溶液，搖勻后，緩慢加入500 μL 濃H2SO4，防止液滴飛濺。避光靜置30 min后，測定OD490nm，并計算其EPS含量。

以0.2 mg/mL葡萄糖作為標準溶液，取溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL補水至2.0 mL，測定不同濃度葡萄糖溶液對應(yīng)的OD490nm。得到線性回歸方程y=7.953x+0.079 5，R2=0.991 5。

1.3.5 單因素實驗

選取碳源(葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖)、氮源組合(胰蛋白胨和酵母提取粉、胰蛋白胨和牛肉膏、牛肉膏和酵母提取粉、蛋白胨和牛肉膏、蛋白胨和胰蛋白胨)、pH(6、6.5、7、7.5、8)、接種量(1%、2%、3%、4%、5%)、發(fā)酵時間(4、8、12、16、24 h)5個變量進行單因素實驗，按照1.3.3的方法提取多糖，按照1.3.4的方法測定菌株胞外多糖產(chǎn)量。

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

用軟件Design Expert 8.0.6 和Box-Behnken Design (BBD) 設(shè)計響應(yīng)面試驗，以培養(yǎng)時間、接種量、pH值作為變量，并選取合適的水平，以產(chǎn)糖量為響應(yīng)值，試驗水平和因素如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 EPS-K4的純化

按優(yōu)化后的發(fā)酵條件大量制備EPS-K4，利用sevage法多次去除蛋白，經(jīng)過24 h透析后，凍干得到粗多糖樣品。稱量100 mg EPS-K4粗多糖樣品充分溶于10 mL去離子水中，用0.22 μm濾膜過濾后，加入平衡后的DEAE Sepharose Fast Flow柱(1.6 cm×25 cm)中用NaCl進行洗脫(洗脫梯度為0、0.01、0.02、0.03、0.04 mol/L)，同時用苯酚硫酸法對EPS含量進行檢測。收集同一組分的多糖洗脫液，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，透析凍干。繼續(xù)利用Sephadex G-75 (1.6 cm×60 cm)柱層析對上一步凍干樣品純化。用苯酚硫酸法于490 nm檢測多糖含量。收集主峰洗脫液，旋蒸濃縮后，透析凍干，得到精制EPS-K4用于后續(xù)研究。

1.5 體外抗氧化性測定

取凍干的精制EPS-K4樣品，配置成0、1、2、3、4、5 mg/mL的樣品溶液，相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸做陽性對照，分別測定抗氧化指標。

1.5.1 DPPH自由基清除能力測定

取2 mL樣品與2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合，在室溫、避光條件下靜置30 min。于517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1，樣品組吸光度;A，等體積無水乙醇代替DPPH溶液的空白組吸光度;A0，等體積無菌水代替樣品的對照組吸光度。

1.5.2 羥基自由基(·OH)清除能力測定

取1 mL 樣品與0.5 mL 9 mmol/L 水楊酸、0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和5 mL 8.8 mmol/L H2O2混合，在室溫、避光條件下靜置30 min，于510 nm處測定吸光度?！H清除率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1，樣品組吸光度；A，等體積無菌水代替FeSO4溶液的空白組吸光度；A0，等體積無菌水代替樣品的對照組吸光度。

1.5.3 總還原力測定

采用鐵氰化鉀法測定多糖的總還原力。取0.5 mL樣品與1.0 mL 1% K3[Fe(CN)6]溶液充分混勻，再加入1 mL 2.0 mol/L的PB緩沖液(pH 6.6)，用旋渦振蕩器充分混勻。將混合溶液迅速且小心轉(zhuǎn)移至在50 ℃恒溫水浴鍋中，反應(yīng)20 min后，快速冷卻，并加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的TCA溶液充分混勻。然后5 000 r/min離心15 min后，吸取2 mL上清液與0.5 mL的0.1% FeCl3溶液充分混勻，再加入1.5 mL的去離子水，10 min后測定OD700nm。

1.6 數(shù)據(jù)處理

樣品進行3次平行實驗，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.1作圖，結(jié)果均以平均值±標準差表示。t檢驗用于2組樣本之間分析，當(dāng)差異分析P<0.05時，認為其具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于16S rDNA 的基因序列相似性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在Gen Bank中，將菌株的16S rDNA 基因序列與相似的已知菌株序列進行比對。選取相似度較高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。菌株與BacillusamyloliquefaciensJxnuwy-1在同一分支上，且置信度高，可將菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。圖2為革蘭氏染色后菌株DMBA-K4的菌落形態(tài)。該菌株經(jīng)染色后呈紫色短桿狀，為革蘭氏陽性菌并具有典型桿菌特征?，F(xiàn)今對微生物胞外多糖的研究普遍聚焦于乳酸菌屬，而涉及解淀粉芽孢桿菌的胞外多糖研究較少。本實驗主要針對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化及其抗氧化活性開展研究。

圖1 基于16S rDNA序列菌株DMBA-K4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain DMBA-K4 based on 16S rDNA sequences

圖2 DMBA-K4 革蘭氏染色菌落形態(tài)觀察Fig.2 The microscopic morphology of strain DMBA-K4

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 碳源選擇

由于自身的酶系和轉(zhuǎn)運能力的差別，微生物對碳源的利用能力各不相同。選擇合適的碳源種類及其添加量，對提高微生物產(chǎn)胞外多糖的能力、提高經(jīng)濟效益具有重要的意義。本實驗對5種不同的碳源進行研究，胞外多糖產(chǎn)量結(jié)果如圖3-a所示。DMBA-K4以蔗糖為碳源時產(chǎn)糖量是LB培養(yǎng)基的2倍。研究發(fā)現(xiàn)，有利于芽孢桿菌高產(chǎn)胞外多糖的碳源多為蔗糖。蔡淼等[14]優(yōu)化甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件時發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為20 g/L的蔗糖是最佳碳源條件。周璇等[15]實驗后確定地衣芽孢桿菌II4-01胞外多糖積累最佳碳源條件為25 g/L蔗糖。

深入探究蔗糖添加量對胞外多糖積累影響，結(jié)果如圖3-b所示。當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為4 g/L時，胞外多糖產(chǎn)量達最大值(150.61 mg/L)。當(dāng)繼續(xù)增加蔗糖濃度，產(chǎn)糖量不再增加，進入平臺期?？紤]經(jīng)濟效益，選擇4 g/L 蔗糖為最佳碳源量。

a-碳源種類對EPS產(chǎn)量的影響;b-蔗糖質(zhì)量濃度對EPS產(chǎn)量的影響圖3 碳源對EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbon sources on the yield of EPS

2.2.2 氮源選擇

氮源是微生物合成蛋白質(zhì)和核酸所不可缺少的原料。研究表明，乳酸菌LPC-1的最佳氮源為大豆蛋白胨[16]；解淀粉芽孢桿菌PB6產(chǎn)EPS最優(yōu)培養(yǎng)基成分之一為2.5 g/L酵母提取物[17]。本實驗設(shè)計5組氮源組合與LB肉湯培養(yǎng)基作對比，探究氮源組合對DMBA-K4的EPS產(chǎn)量作用，結(jié)果如圖4-a所示。胰蛋白胨+酵母粉組的EPS產(chǎn)量最高，達158.21 mg/L，是LB肉湯培養(yǎng)基的2倍。

圖4-b為該組合的配比對EPS產(chǎn)量影響的結(jié)果。解淀粉芽孢桿菌利用酵母粉生產(chǎn)胞外多糖的能力較強，隨著酵母粉含量的增加，EPS逐漸積累。當(dāng)其質(zhì)量比為5∶10時，EPS積累能力最強。過量的酵母粉不利于EPS的生產(chǎn)，可能是由酵母粉對菌體的滲透壓脅迫作用造成的。

因此在后續(xù)發(fā)酵條件研究中，以4 g/L 蔗糖、5 g/L胰蛋白胨、10 g/L 酵母提取粉、5 g/L NaCl為DMBA-K4培養(yǎng)基配方。

a-氮源組合對EPS產(chǎn)量的影響;b-胰蛋白胨與酵母粉比例對EPS產(chǎn)量的影響圖4 氮源對EPS產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources on the yield of EPS

2.2.3 發(fā)酵時間影響

發(fā)酵時間是影響微生物EPS積累的一個重要因素。發(fā)酵時間太短，菌體只能進行個體生長，無法完成EPS的積累；發(fā)酵時間過長，環(huán)境中的酶系有可能分解EPS，影響產(chǎn)糖效率[18]。由圖5-a可知，EPS產(chǎn)量隨發(fā)酵時間逐漸增加，在18 h時積累的EPS達到最大值164.62 mg/L。隨發(fā)酵時間繼續(xù)延長，EPS產(chǎn)量出現(xiàn)下降趨勢。該變化趨勢與許多研究結(jié)果一致[19-20]，但相應(yīng)的時間卻不盡相同，說明針對不同的菌株選擇合適的發(fā)酵時間是積累EPS的重要基礎(chǔ)。

2.2.4 發(fā)酵初始pH影響

合適的pH可使相關(guān)酶系保持較高活性，有利于微生物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累[21]。本實驗將pH變量設(shè)為6～8，結(jié)果如圖5-b所示。隨著pH從弱酸性向中性過渡，EPS產(chǎn)量不斷增加并在pH為7.5時達到最大值169 mg/L。中性環(huán)境更有利于DMBA-K4的EPS積累。

2.2.5 接種量影響

如圖5-c所示，當(dāng)接種量為1%時，菌體生長繁殖速率較低，代謝產(chǎn)物積累較少。接種量為2%～4%時，菌體可利用的營養(yǎng)物質(zhì)豐富、生長速率較快，EPS生產(chǎn)能力快速提高。當(dāng)接種量為5%時，菌體出現(xiàn)營養(yǎng)競爭，合成EPS能力下降。該結(jié)果與劉剛等[22]、RAZA等[23]報道一致。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

a-發(fā)酵時間;b-發(fā)酵初始pH;c-接種量圖5 三因素對EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of each factors on the yield of EPS

2.4 各因素之間響應(yīng)面交互作用分析

圖6反映各因素間的交互作用，當(dāng)固定其中一個因素水平為0時，另外2個因素的相互作用強弱可以通過等高線圖來表示，形狀越趨近于橢圓則表明交互作用顯著。結(jié)果表明，各因素間相互作用等高線均為橢圓形，因此可認為各因素間交互作用強。

圖6 各因素間對EPS產(chǎn)量的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour and response surface about the effects of two factors on the yield of EPS

根據(jù)Design Expert 軟件分析并結(jié)合實際操作性可知：高產(chǎn)EPS的優(yōu)化發(fā)酵條件為發(fā)酵時間18 h、pH 7.6、接種量3.10%，理論EPS產(chǎn)量為169.94 mg/L。在此基礎(chǔ)上進行驗證試驗，經(jīng)3次平行實驗得DMBA-K4的EPS產(chǎn)量為(171.31±2.13) mg/L，與理論值的誤差為0.80%，證明本試驗優(yōu)化獲得的發(fā)酵條件結(jié)果正確，具有實踐意義。

2.5 EPS體外抗氧化性分析

本實驗從3個方面測定菌株DMBA-K4胞外多糖的體外抗氧化性，分別是DPPH自由基清除率、·OH清除率和總還原力，并以抗壞血酸為陽性對照(圖7)。

DPPH被廣泛應(yīng)用于評價天然化合物的自由基清除能力，其途徑抗氧化劑與DPPH自由基的單電子結(jié)合，形成穩(wěn)定的DPPH[24]。如圖7-a所示，DMBA-K4的EPS對DPPH具有一定的清除能力并與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，其DPPH自由基清除率達78.60%。在相同EPS濃度下，比較益生菌PediococcuspentosaceusM41和野生型Lactobacillusdelbureckii的DPPH清除率分別為69.94%[25]和68.60%[26]。相較之下，DMBA-K4的EPS具有更強DPPH清除能力，這與其單糖組成、特定官能團含量以及供氫能力相關(guān)。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model for response surface test

·OH是活性氧中最有害的自由基，對人體核酸、碳水化合物等大分子具有較強破壞作用[27]。1～4 mg/mL EPS對·OH清除能力遠低于抗壞血酸，但當(dāng)質(zhì)量濃度達5 mg/mL時，清除率可達75.47%，展現(xiàn)出良好的抗氧化性(圖7-b)。WANG等[28]發(fā)現(xiàn)從Umbilicariaesculenta提取的EPS在4 mg/mL時·OH清除率為67.54%，孫建瑞等[29]發(fā)現(xiàn)C.vulgaris224的EPS僅在30 mg/mL時對·OH的清除率超50%。胞外多糖可以充當(dāng)電子或氫供體，達到清除·OH的目的。

總還原力是評價化合物抗氧化性的重要指標之一。在本實驗中，EPS的給電子能力隨著將Fe3+/鐵氰化物配合物還原成亞鐵形式的過程而減弱，結(jié)果如圖7-c所示。EPS的總還原力隨質(zhì)量濃度的增加而增強。在5 mg/mL時，OD700nm為0.40，低于抗壞血酸，這可能是EPS中缺失游離的醛基或酮基造成的。

a-DPPH清除率;b-·OH清除率;c-總還原力圖7 DMBA-K4胞外多糖的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of EPS produced by DMBA-K4

3 結(jié)論

針對1株從云南普洱茶中分離的產(chǎn)EPS的菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定為解淀粉芽孢桿菌DMBA-K4。目前對EPS的研究主要是關(guān)于乳酸菌的，而關(guān)于解淀粉芽孢桿菌的EPS研究較少。本實驗通過單因素實驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化其高產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件，結(jié)果為4 g/L 蔗糖、5 g/L胰蛋白胨、10 g/L 酵母提取粉、5 g/L NaCl、發(fā)酵時間18 h、pH 7.6、接種量3.10%。優(yōu)化后，EPS產(chǎn)量為171.31 mg/L，提高155.7%。評價得到的粗多糖的體外抗氧化性，結(jié)果表明，該EPS對DPPH自由基和·OH具有明顯清除效果，也具有一定的總還原能力。新型的生物活性多糖在化工、藥物、食品等工業(yè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，微生物發(fā)酵比傳統(tǒng)的種植具有更高的效率和經(jīng)濟效益。因此，解淀粉芽孢桿菌DMBA-K4產(chǎn)的EPS在功能食品研發(fā)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。