OGD/R星形膠質細胞DNMT3a、tPA表達與凋亡變化及腺苷甲硫氨酸的干預作用

張曉璐

江蘇省蘇北人民醫(yī)院，江蘇揚州225001

圍產期缺氧是導致新生兒腦損傷最普遍的原因。新生兒缺血缺氧性腦病(NHIE)主要造成急性死亡和慢性神經系統(tǒng)功能障礙[1]。目前，對于NHIE的治療，除低體溫療法用于治療輕度新生兒窒息所致腦病以外，尚無普遍公認的治療手段。最近研究表明，在早期腦缺氧缺血過程中，表觀遺傳學改變起到關鍵作用[2]。當神經細胞暴露在短暫的缺氧條件下，多種影響中樞神經系統(tǒng)發(fā)育和功能的基因啟動子區(qū)域發(fā)生去甲基化，從而上調相關基因的表達。組織型纖溶酶原激活物(tPA)是一種絲氨酸蛋白酶，在腦內主要由膠質細胞表達，在細胞凋亡、神經可塑性等方面都起著重要作用[3]。2017年1月～2020年6月，本研究體外培養(yǎng)大鼠皮質星形膠質細胞，通過糖氧剝奪/復氧復糖(OGD/R)細胞模型模擬新生兒NHIE，同時使用DNA甲基轉移酶(DNMT)激活劑S-腺苷甲硫氨酸(SAM)進行干預，觀察DNMT3a、tPA和凋亡相關因子水平變化?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 健康清潔級新生24 h內SD大鼠乳鼠，雌雄不限，體質量4～6 g，購于揚州大學比較醫(yī)學中心。動物生長環(huán)境：溫度18～24 ℃，濕度50%～60%，12 h晝夜交替，自由攝食、飲水。高糖DMEM培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。SAM、多聚賴氨酸購自美國Sigma公司。MTT購自Solarbio公司。RIPA細胞裂解液購自Applygen公司。TRIzol試劑、熒光標記二抗Alexa Fluor 594山羊抗鼠IgG購自美國Invitrogen公司。核蛋白提取試劑盒購自KeyGen Biotech公司。DNA Methyltransferase活性檢測試劑盒購自美國Epigentek公司。RevertAid First Strand cDNA試劑盒、DAPI購自美國Thermofisher Scientific公司。AceQ qPCR SYBR Green Master Mix PCR試劑盒購自Vazyme公司。兔多克隆抗DNMT3a抗體、兔多克隆抗tPA抗體、小鼠單克隆抗GFAP抗體購自英國Abcam公司。鼠單克隆抗Bcl-2抗體、兔多克隆抗Bax抗體購自美國Santa Cruz公司。兔多克隆抗Cleaved Caspase-3抗體、兔抗多克隆GAPDH抗體、HRP羊抗兔二抗購自美國Cell signaling公司。HRP羊抗鼠二抗購自美國BD Biosciences公司?？篃晒獯銣绶馄瑒┵徸訠eyotime公司。本研究通過揚州大學動物倫理委員會批準。

1.2 大鼠皮質星形膠質細胞分離、培養(yǎng)與鑒定 取新生1～2 d的SD大鼠乳鼠，70%乙醇消毒頭頸部，用鋒利剪刀剪下頭部，無菌條件下取出乳鼠大腦皮質，用無菌過濾紙移除腦膜和血管，組織剪碎后用0.25%胰酶37 ℃消化10 min，加入配制的培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清+100 U/mL青-鏈霉素)，反復洗滌3次，用100 μm濾網(wǎng)過濾后離心(200 r/min，10 min)，加入上述配制的培養(yǎng)基重懸，將細胞接種在多聚賴氨酸包被的75 cm2培養(yǎng)瓶中。放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后，應用星形膠質細胞特異性蛋白GFAP免疫熒光細胞染色和DAPI細胞核染色進行細胞純度鑒定。選擇純度>95%的星形膠質細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 OGD/R細胞模型建立與分組處理 取培養(yǎng)10 d的星形膠質細胞進行傳代，當細胞生長達到80%密度時，洗滌2次，將正常培養(yǎng)基替換成無糖培養(yǎng)基(去血清無糖DMEM+青-鏈霉素)，細胞培養(yǎng)皿置于缺氧小室內，持續(xù)通入含有95%N2和5%CO2的混合氣體；通氣10 min夾閉缺氧小室進出口，繼續(xù)培養(yǎng)3、6、12 h后取出缺氧小室，換回正常培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；采用MTT法檢測細胞存活力，以細胞存活率90%為標準，確定缺糖缺氧3 h后再復氧復糖24 h作為細胞模型制作條件[4]。將細胞分為對照組、OGD/R組、OGD/R+SAM組。對照組常規(guī)培養(yǎng)。OGD/R組、OGD/R+SAM組參照前述方法，以缺糖缺氧3 h后再復氧復糖24 h建立OGD/R細胞模型[4]。OGD/R+SAM組在OGD/R過程中細胞培養(yǎng)基始終保持有50 μmol/L的SAM。造模完成后進行后續(xù)檢測。

1.4 DNMT活性測定 使用核蛋白提取試劑盒提取各組細胞核蛋白并做蛋白定量。取10 μg核蛋白，使用Epigentek DNMT活性檢測試劑盒，根據(jù)說明書檢測DNMT活性。

1.5 DNMT3a、tPA mRNA及蛋白檢測 ①DNMT3a、tPA mRNA檢測：使用TRIzol試劑提取總RNA，檢測RNA濃度；使用ReverAid First Strand cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA；使用AceQ qPCR SYBR試劑盒，取20 μL的cDNA進行PCR擴增；DNMT3a mRNA上游引物序列為5′-AGGAAGCCCATCCGGGTGCTA-3′、下游引物序列為5′-AGCGGTCCACTTGGATGCCC-3′，tPA mRNA上游引物序列為5′-AGCAAGGCACGGGACACGGA-3′、下游引物序列為5′-GGTCAGGCAACGTGAACGCC-3′，內參GAPDH上游引物序列為5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′、下游引物序列為5′-ACTTGGCAGGTTTCTCCAGG-3′；以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。②DNMT3a、tPA蛋白檢測：使用RIPA裂解緩沖液提取各組細胞總蛋白并進行蛋白定量；蛋白提取物加載到聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行蛋白分離并轉至PVDF膜；轉膜后用5%脫脂奶粉封閉，洗膜3次，分別加入DNMT3a(1∶1 000)、tPA(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜;洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗室溫孵育2 h；使用ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，用目的蛋白灰度值除GAPDH蛋白灰度值，以對照組均數(shù)進行標準化，計算目的蛋白相對表達量。

1.6 凋亡相關蛋白檢測 采用Western blotting法檢測各組細胞中的Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3。使用RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白并進行蛋白定量；蛋白提取物加載到聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行蛋白分離并轉至PVDF膜；轉膜后用5%脫脂奶粉封閉，洗膜3次，分別加入Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、Cleaved Caspase-3(1∶500)及GAPDH(1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜;洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗室溫孵育2 h；使用ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析灰度值并計算蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組DNMT活性比較 對照組、OGD/R組、OGD/R+SAM組DNMT活性分別為4.376±0.255、3.471±0.146、4.145±0.135。OGD/R組DNMT活性低于對照組(P<0.01)，OGD/R+SAM組DNMT活性高于OGD/R組(P<0.05)。

2.2 各組細胞中DNMT3a、tPA mRNA及蛋白表達比較 OGD/R組DNMT3a mRNA和蛋白表達低于對照組，tPA mRNA和蛋白表達高于對照組(P均<0.05)；OGD/R+SAM組DNMT3a mRNA表達高于OGD/R組，tPA mRNA和蛋白表達低于OGD/R組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組細胞中DNMT3a、tPA mRNA及蛋白表達比較

2.3 各組細胞中凋亡相關蛋白表達比較 OGD/R組Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax低于對照組，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達高于對照組(P均<0.01)；OGD/R+SAM組Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax高于OGD/R組，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達低于OGD/R組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 各組細胞中凋亡蛋白表達比較

3 討論

NHIE引起一系列細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應等，目前可用的治療策略非常有限[5]。在NHIE發(fā)病過程中，星形膠質細胞的功能障礙發(fā)揮著非常重要的作用[6]。近年來，NHIE發(fā)病過程中DNA甲基化水平與相關基因表達成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物DNA甲基化在不同細胞種類中均由DNMTs(DNMT1/DNMT3a/DNMT3b)催化。在DNA甲基化的過程中，甲基化的CpG二核苷酸能被甲基化CpG結合域蛋白家族識別并黏附，造成染色質重塑和基因沉默[7]。妊娠期缺氧可能導致胎兒大腦持續(xù)的全腦低甲基化，從而引起大腦對缺氧誘導的損傷敏感，造成神經行為學功能紊亂[8]。SAM作為甲基供體，是一種參與甲基轉移反應的輔酶，在腦缺血過程中可升高DNA甲基化水平，可作為DNA甲基化激活劑，防止海馬區(qū)神經元退行性變[9]。本研究結果顯示，OGD/R可降低細胞DNMT活性，同時在基因和蛋白水平上，使DNMT3a表達明顯下降；而SAM可逆轉由OGD/R誘導的DNMT活性以及DNMT3a表達的下降，表明SAM可逆轉OGD/R引起的DNA甲基化水平降低。

中樞神經系統(tǒng)中tPA的誘導表達是新生大腦缺氧缺血后的特異性反應，而在成人大腦缺血缺氧損傷后，tPA表達下降[10]。tPA在中樞神經系統(tǒng)中具有復雜的功能:一方面，tPA可預防和治療由大腦缺氧缺血誘導血管內血栓形成而引起的一系列大腦損傷；另一方面，tPA對未成熟大腦實質具有多種有害影響，主要包括組織蛋白水解、繼發(fā)性腦水腫破壞血腦屏障、小膠質細胞活化、谷氨酰胺興奮毒性損傷神經元和少突膠質細胞等，也可通過tPA下游調節(jié)因子調節(jié)多種有害反應[11]。本研究中，OGD/R狀態(tài)下星形膠質細胞中tPA的表達明顯升高，而應用DNA甲基化激活劑SAM可逆轉OGD/R誘導的tPA表達升高。有前期研究發(fā)現(xiàn)，應用DNMT抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞嘧啶干預星形膠質細胞，可顯著上調tPA的表達[12]。以上研究提示，OGD/R誘導的tPA表達升高可能與DNA甲基化水平降低有關，這需要進一步論證。檢測tPA啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平變化可作為二者關系的證據(jù)，這將是我們下一步研究的重點。

大量研究表明，未成熟大腦的發(fā)育過程及腦缺氧、創(chuàng)傷等損傷過程中，細胞凋亡程度與新生鼠缺血缺氧性腦損傷密切相關。此外，在急慢性神經退行性變的發(fā)病過程中，星形膠質細胞凋亡能進一步影響神經元的存活[13]。細胞凋亡涉及多種因素，其中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的比例對細胞存活起到重要作用[14]。Caspase-3在各種凋亡途徑中發(fā)揮促凋亡功能。在凋亡開始后，Caspase-3被裂解并激活成為Cleaved Caspase-3，傳遞凋亡信號給下游的靶基因發(fā)揮作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R可使星形膠質細胞中Bcl-2/Bax下降、Cleaved Caspase-3表達上調，給予SAM可逆轉上述影響。但有研究顯示，阻斷DNMT可抑制由氧化應激引起的小腦皮質神經元的凋亡[16]。本研究所得結果與其相反，這可能與細胞類型、損傷模型制作等實驗條件不同相關。

結合上述研究結果，我們認為，OGD/R的星形膠質細胞DNA甲基化水平降低，tPA表達上調，促進細胞凋亡；而SAM干預可逆轉OGD/R導致的上述改變。DNA甲基化水平升高可抑制OGD/R誘導的細胞凋亡過程，部分是通過降低tPA的表達來完成。這些結果為DNA甲基化激活劑在NHIE治療中的應用提供了理論依據(jù)。