高壓氧治療對(duì)大鼠腎移植后缺血再灌注腎組織中RIP-1、RIP-3表達(dá)水平的影響

李浩，杜江，陳安健，杜洋，梁天才，付梓峰，謝智慧，梁國(guó)標(biāo)

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州遵義563000

缺血再灌注損傷(IRI)被認(rèn)為是影響腎移植效果的重要因素。IRI的發(fā)生受許多因素影響，如Ca2+超載、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、免疫系統(tǒng)激活、基因轉(zhuǎn)錄重新編程、血管內(nèi)皮損傷等[1]。缺血的腎臟經(jīng)再灌注后會(huì)進(jìn)一步加重缺氧和炎癥程度[2]。Degterev等[3]研究發(fā)現(xiàn)，一種具有壞死形態(tài)學(xué)特征并受多種因子作用影響的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，能按照固定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和執(zhí)行程序發(fā)生，并將這種現(xiàn)象稱(chēng)為壞死性凋亡。受體相互作用蛋白激酶(RIP)1和RIP-3是壞死性凋亡主要通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，可啟動(dòng)和調(diào)控壞死性凋亡的發(fā)生發(fā)展[4]。研究顯示，壞死性凋亡在IRI中可發(fā)揮比凋亡更為重要的作用，這為防治腎臟IRI提供了新的探索方向[5,6]。高壓氧(HBO)治療方法是將患者置身于高于標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的環(huán)境里呼吸100%的氧氣，其主要用于治療減壓綜合征、急性CO中毒、氣性壞疽、糖尿病足等疾病[7]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，移植腎缺血再灌注后，HBO治療可通過(guò)減輕組織炎癥反應(yīng)，降低腎IRI對(duì)腎功能的損害；還可能通過(guò)增強(qiáng)自噬作用，減輕腎IRI，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[8]。但HBO對(duì)移植腎組織壞死性凋亡影響的相關(guān)研究較少。2016年9月～2018年3月，本研究擬通過(guò)腎移植技術(shù)，建立大鼠腎IRI模型，觀察HBO治療對(duì)腎組織RIP-1、RIP-3表達(dá)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要實(shí)驗(yàn)材料 健康6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠于溫度16～26 ℃、相對(duì)濕度45%～70%環(huán)境中分籠飼養(yǎng)2周。RIP-1蛋白抗體購(gòu)于美國(guó)Proteintech Group公司，RIP-3蛋白抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，抗體稀釋液、山羊血清、多聚體抗兔IgG-HRP、蘇木素染液、PBS緩沖液、枸櫞酸緩沖液購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 腎移植IRI模型制作及分組處理 90只大鼠隨機(jī)分為腎移植組、HBO治療組各36只，假手術(shù)組18只。腎移植組、HBO治療組參考Bao等[8]方法建立左腎移植IRI模型。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：供體大鼠左側(cè)腎臟在體灌注后，腎臟顏色蒼白，恢復(fù)血液再灌注后移植腎動(dòng)脈恢復(fù)搏動(dòng)，蒼白的腎臟逐漸變紅潤(rùn)，觀察5～10 min見(jiàn)輸尿管有尿液流出。假手術(shù)組不進(jìn)行腎移植操作，行右腎切除術(shù)后關(guān)閉腹腔。HBO治療組分別于腎移植術(shù)后0、2、4 h置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙內(nèi)，純氧洗艙5 min后加壓至0.02 MPa，5 min后再加壓至0.1 MPa，穩(wěn)壓吸氧40 min后減壓10 min，共計(jì)1 h，保持艙內(nèi)氧濃度在95%以上。腎移植組及HBO治療組大鼠分別于再灌注后1、3、5 h經(jīng)腹腔注射麻醉后切取移植腎，假手術(shù)組于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)切取左腎，并處死大鼠(各時(shí)點(diǎn)6只)。取腎臟部分皮髓質(zhì)，用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋切片(5 μm厚)，以備HE染色和免疫組化檢測(cè)。

1.3 腎組織病理觀察 采用HE染色，顯微鏡下觀察各組腎組織病理變化。

1.4 腎組織中RIP-1、RIP-3蛋白檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)各組腎組織中的RIP-1、RIP-3蛋白。步驟如下：制備5 μm厚石蠟切片并脫蠟至水；PBS沖洗后將切片置入3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；將切片完全浸泡在盛有EDTA抗原修復(fù)液的修復(fù)盒中，微波抗原修復(fù)，室溫下自然冷卻后滴加正常山羊血清封閉液；滴加一抗(RIP-1 1∶100、RIP-3 1∶100)，陰性對(duì)照滴加PBS代替一抗，置入濕盒中4 ℃冰箱過(guò)夜；溫箱復(fù)溫后滴加多聚體抗兔IgG-HRP(二抗)，37 ℃溫箱孵育；鏡下DAB顯色后蘇木素染色；1%鹽酸乙醇中分化3 s并沖洗10 min；脫水，透明，封片，鏡下觀察結(jié)果。以腎臟組織中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為RIP-1、RIP-3陽(yáng)性表達(dá)。顯微鏡高倍視野下(400×)每張切片隨機(jī)采集5個(gè)視野，Leica Qwin圖像處理系統(tǒng)采集圖像，用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測(cè)量積分光密度(IOD)值，作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組腎組織病理變化 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)腎組織結(jié)構(gòu)基本正常。腎移植組腎小管管腔擴(kuò)張，腎小球體積增大，上皮細(xì)胞明顯腫脹，部分組織呈現(xiàn)顆粒樣變性，并出現(xiàn)蛋白樣管型及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)而損傷加重。HBO治療組有不同程度腎小管管腔擴(kuò)張、腎小球體積增大及上皮細(xì)胞腫脹變形，有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和顆粒樣變性，組織損傷較腎移植組減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理變化(HE染色，400×)

2.2 各組腎組織RIP-1、RIP-3蛋白表達(dá)比較 HBO治療組、腎移植組再灌注后1、3、5 h腎組織中RIP-1、RIP-3蛋白表達(dá)均逐漸升高，組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)相比，P均<0.05。HBO治療組、腎移植組再灌注后1、3、5 h腎組織中RIP-1、RIP-3蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組，且HBO治療組相同時(shí)點(diǎn)腎組織中RIP-1、RIP-3蛋白表達(dá)低于腎移植組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1、2。

表1 各組腎組織RIP-1蛋白表達(dá)比較

表2 各組腎組織RIP-3蛋白表達(dá)比較

3 討論

IRI指在各種原因?qū)е氯毖A(chǔ)上，組織器官恢復(fù)血流再灌注后，細(xì)胞出現(xiàn)代謝障礙并使其功能和結(jié)構(gòu)破壞，損傷程度反而加重的現(xiàn)象。缺血導(dǎo)致氧供降低，引起嚴(yán)重的缺氧與微血管功能障礙。而再灌注后可進(jìn)一步觸發(fā)激活免疫反應(yīng)以及程序性細(xì)胞死亡等損傷機(jī)制，加重組織器官功能損害[9]。對(duì)于腎移植患者，腎IRI是影響早期腎功能恢復(fù)和患者長(zhǎng)期存活的主要因素之一[10]。

壞死性凋亡是細(xì)胞死亡形式的特殊類(lèi)型，是呈現(xiàn)壞死形態(tài)學(xué)特征并受多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子作用影響的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡一般發(fā)生于病毒感染和細(xì)菌感染，同時(shí)也發(fā)生在神經(jīng)退行性疾病、炎癥及器官I(mǎi)RI中[11]。壞死性凋亡是一種由死亡受體及配體啟動(dòng)，依賴(lài)RIP介導(dǎo)活化非Caspase依賴(lài)的可調(diào)控程序性壞死。RIP屬于絲氨酸/酪氨酸激酶家族，是參與細(xì)胞凋亡、壞死的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。RIP共有7個(gè)家族成員，其中RIP-1、RIP-3在啟動(dòng)和調(diào)控壞死性凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明，RIP-3是細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡所必需的蛋白激酶[12]。

壞死性凋亡的主要通路如下：當(dāng)Caspase受到抑制時(shí)，RIP-1在TNF-α或Fas刺激誘導(dǎo)下被激活，并與RIP-3在磷酸化等作用下形成necrosome信號(hào)復(fù)合體，進(jìn)一步激活RIP-3使混合系激酶結(jié)構(gòu)蛋白(MLKL)磷酸化，打開(kāi)下游通路，MLKL被激活后由單體狀態(tài)轉(zhuǎn)化為寡聚體狀態(tài)，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，并形成通透性孔道，破壞細(xì)胞膜的完整性，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死。RIP-1和RIP-3形成necrosome復(fù)合體是發(fā)生壞死性凋亡的特異性標(biāo)志[13]。當(dāng)細(xì)胞在病理狀態(tài)下不能產(chǎn)生足夠的ATP以維系Caspase功能時(shí)，依賴(lài)Caspase作用的細(xì)胞凋亡通路出現(xiàn)障礙，很容易導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不依賴(lài)Caspase的壞死性凋亡[14]。因此，壞死性凋亡參與許多疾病的病理過(guò)程和器質(zhì)性損傷，尤其是在IRI、急性炎癥、病毒感染中發(fā)揮著重要作用[15]。

HBO的治療機(jī)制被認(rèn)為與升高氧分壓有關(guān)，一定劑量的HBO可使機(jī)體抗氧化能力加強(qiáng)，可以清除過(guò)多氧自由基，從而保護(hù)組織細(xì)胞免受自由基的氧化損傷，這是HBO治療許多疾病的重要分子基礎(chǔ)[16]。HBO還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水、電解質(zhì)平衡，調(diào)節(jié)缺血部位微血管舒縮，改善微循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)，減輕局部水腫等作用，提高組織液和血液的氧含量、氧張力并增強(qiáng)能量代謝和有氧氧化，進(jìn)而改善局部缺氧情況[17]。另外，HBO還可提高Na+-K+-ATP酶活性，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，使細(xì)胞膜功能恢復(fù)正常，這些作用有利于減輕腎IRI、保護(hù)腎功能[18]。既往研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)參與了腎IRI的病理生理過(guò)程，HBO可通過(guò)上調(diào)HIF-1α mRNA的表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)腎功能的作用[19]。我們還發(fā)現(xiàn)，IRI可能通過(guò)誘導(dǎo)TNF-α和氧自由基的大量產(chǎn)生，加重腎組織細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重腎功能損害；而HBO干預(yù)可能通過(guò)抑制TNF-α和丙二醛的產(chǎn)生，減輕組織脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腎保護(hù)效應(yīng)。

本研究前期工作發(fā)現(xiàn)，再灌注后腎功能受到明顯損害，HBO能明顯減輕腎IRI，保護(hù)腎功能，其機(jī)制主要包括減輕組織炎癥反應(yīng)和增強(qiáng)自噬作用等[8]。研究還發(fā)現(xiàn)，HBO治療可通過(guò)抑制ICAM-1和VCAM-1過(guò)表達(dá)、C3補(bǔ)體活化、ED1浸潤(rùn)和Th17細(xì)胞的聚集發(fā)揮腎保護(hù)作用[20]。我們?cè)谇捌诠ぷ鞯幕A(chǔ)上，初步探討了壞死性凋亡關(guān)鍵因子在IRI腎組織中的表達(dá)變化以及HBO對(duì)其表達(dá)的影響。本研究結(jié)果顯示，在腎移植后RIP-1、RIP-3的表達(dá)隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增高，HBO治療后其表達(dá)水平則顯著降低，并隨時(shí)間延長(zhǎng)越來(lái)越明顯。這表明，再灌注早期即可發(fā)生RIP-1、RIP-3的表達(dá)增高，激活壞死性凋亡相關(guān)通路，進(jìn)而加重腎臟損害。HBO治療有助于減少RIP-1、RIP-3的表達(dá)，抑制壞死性凋亡的發(fā)生，從而減輕腎IRI，實(shí)現(xiàn)保護(hù)腎臟的目的。通過(guò)HE染色也觀察到，HBO治療后移植腎組織的病理改變也得到明顯改善。

綜上所述，IRI能顯著誘導(dǎo)RIP-1、RIP-3在腎組織中的表達(dá)，而HBO治療能明顯抑制二者的表達(dá)，這是HBO在腎IRI中發(fā)揮腎保護(hù)作用的又一重要機(jī)制。但壞死性凋亡在腎IRI發(fā)生中的作用機(jī)制以及HBO對(duì)壞死性凋亡調(diào)控的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。