基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的枳術(shù)丸治療慢傳輸型便秘的潛在分子機(jī)制

武鵬飛，龐雪，辛學(xué)知

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250014；2 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院

慢傳輸型便秘(STC)是因?yàn)榻Y(jié)腸動(dòng)力障礙，腸內(nèi)容物通過結(jié)腸過慢或停滯所引發(fā)的便秘。臨床中西醫(yī)對(duì)于STC的治療常采用促分泌劑、促動(dòng)力劑、手術(shù)等手段，但不良反應(yīng)較大，甚至加重便秘。枳術(shù)丸出自李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，全方僅枳實(shí)、白術(shù)兩味藥，但配伍巧妙?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)中主要活性成分為內(nèi)酯類，具有促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)和吸收的作用；枳實(shí)中主要活性成分為生物堿和黃酮類，具有改善胃和小腸排空、抗炎、抗菌、抗氧化的作用。但是，該藥在細(xì)胞與分子層面的機(jī)制尚未闡明。2020年3～5月，我們以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為依托，結(jié)合分子靶點(diǎn)與疾病之間的相互作用，探索枳術(shù)丸治療STC的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 枳術(shù)丸主要化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)篩選 依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)[1](http://tcmspw.com/tcmsp.php)，輸入組成枳術(shù)丸的兩味中藥名枳實(shí)、白術(shù)，搜索得到各自的化學(xué)成分；以口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為指標(biāo)對(duì)化合物進(jìn)行篩選，得到符合條件的化合物；再次通過查詢?cè)撈脚_(tái)，得到與化合物對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。此外，通過查閱已發(fā)表的文獻(xiàn)，補(bǔ)充因篩選指標(biāo)而被舍棄的重要化合物的靶點(diǎn)。為得到標(biāo)準(zhǔn)化的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，將得到的靶點(diǎn)上傳至Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 藥物分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及STC致病相關(guān)靶點(diǎn)篩選 將上述枳術(shù)丸中各藥物的化合物及蛋白質(zhì)靶點(diǎn)上傳Cytoscape3.7.2軟件，進(jìn)行枳術(shù)丸化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org)，以“Slow transit constipation”為關(guān)鍵詞，挖掘STC的疾病潛在靶點(diǎn)，通過Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)[2](https://www. drugbank.ca)搜索治療STC的一線西藥靶點(diǎn)作為補(bǔ)充。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)篩選大于“Relevance score”中位數(shù)的靶點(diǎn)作為STC的潛在靶點(diǎn)，若靶點(diǎn)過多，則再次篩選；將上述結(jié)果與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到的結(jié)果整合，刪除重復(fù)值，得到STC的潛在致病靶點(diǎn)。

1.3 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為進(jìn)一步明晰枳術(shù)丸藥物相關(guān)靶點(diǎn)與STC疾病靶點(diǎn)之間的作用，將二者靶點(diǎn)取交集，在R語(yǔ)言軟件上繪制韋恩圖；將二者交集靶點(diǎn)上傳至String11.0平臺(tái)[3](https://string-db.org)，最小相互作用閾值“highest confidence”選擇>0.9，其余設(shè)置均為默認(rèn)值，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治雠c核心靶點(diǎn)篩選 選擇Cytoscape3.7.2軟件中的BisoGenet插件，點(diǎn)擊“Tools-Network Analyzer-Network Analysis-Analyze Network”，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能分析；然后利用CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，在Centralities中勾選除“degree”之外的全部選項(xiàng)，點(diǎn)擊“analyze”進(jìn)行分析，并將結(jié)果以.csv格式導(dǎo)出，以便使用Excel打開查看。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，若靶點(diǎn)過多則使用關(guān)鍵屬性值的2倍中位數(shù)作為核心靶點(diǎn)篩選條件的最小值，第一次篩選條件設(shè)定為degree>50，第二次篩選條件設(shè)定為degree>166、betweenness>1 578.81。

1.5 核心靶點(diǎn)的GO富集分析與KEGG通路分析 利用Bioconductor生物信息軟件包(http:// www.bioconductor.org)，使用R語(yǔ)言軟件，以P≤0.05對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路分析，并選取P值排名前20的結(jié)果。

1.6 STC致病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建STC致病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步明確靶點(diǎn)與信號(hào)通路在枳術(shù)丸治療STC中的作用。

2 結(jié)果

2.1 枳術(shù)丸活性成分及其靶點(diǎn) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)初步提取枳實(shí)化學(xué)成分65種、白術(shù)化學(xué)成分55種，經(jīng)過ADME篩選后獲得枳實(shí)18種、白術(shù)4種(表1)。再將上述化學(xué)成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索與之相對(duì)應(yīng)的成分作用靶點(diǎn)，經(jīng)篩選后獲得枳實(shí)266、白術(shù)22個(gè)，合并以后刪除重復(fù)值共得到成分作用靶點(diǎn)126個(gè)。

2.2 藥物分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 從藥物分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中共得到149個(gè)節(jié)點(diǎn)，309條邊。其中枳術(shù)丸治療STC的核心活性成分為木犀草素、柚皮素、川陳皮素等。

表1 枳術(shù)丸主要活性成分

2.3 STC致病相關(guān)靶點(diǎn)獲取結(jié)果 搜索關(guān)鍵詞得到靶點(diǎn)3 278個(gè)，經(jīng)篩選、整合、刪重最終得到861個(gè)STC潛在致病靶點(diǎn)。

2.4 枳術(shù)丸藥物靶點(diǎn)與STC致病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將枳術(shù)丸藥物靶點(diǎn)與STC致病靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)67個(gè)；將得到交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，得到枳術(shù)丸治療STC的核心靶點(diǎn)有MAPK3、MAPK1、AKT1、IL6、TP53、JUN等。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果 根據(jù)“1.4”之中的篩選條件，得到一個(gè)7 768個(gè)節(jié)點(diǎn)、176 055條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖；以degree值的2倍中位數(shù)進(jìn)行一次篩選后，得到一個(gè)2 091個(gè)節(jié)點(diǎn)、86 910條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖；再以degree值、betweenness值的2倍中位數(shù)進(jìn)行篩選后，得到一個(gè)192個(gè)節(jié)點(diǎn)、6 579條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6 核心靶點(diǎn)的GO 富集分析與 KEGG 通路分析結(jié)果

2.6.1 GO富集分析結(jié)果 共得出生物學(xué)過程(BP)1 890個(gè)、分子功能(MF)51個(gè)、細(xì)胞組成(CC)83個(gè)；BP涉及細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、對(duì)輻射的反應(yīng)、對(duì)紫外線(UV)的反應(yīng)，CC涉及細(xì)胞周期素—依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、蛋白激酶復(fù)合物、膜筏、膜微域等，MF涉及磷酸酶結(jié)合、泛素-樣蛋白連接酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、BH結(jié)構(gòu)域綁定等。

2.6.2 KEGG 通路分析結(jié)果 共得出162條通路，其共同靶點(diǎn)在前列腺癌、內(nèi)分泌抗性、乙型肝炎、卡波西肉瘤-相關(guān)皰疹病毒感染等疾病和IL-17信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路等上富集較多。

2.7 STC致病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 通過STC致病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步明確，枳術(shù)丸治療STC核心靶點(diǎn)主要有AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、TP53等。

3 討論

中藥復(fù)方治療STC自古就有良好的效果，其治療效果優(yōu)于臨床一線西藥。劉芳等[4]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于STC熱秘證患者，服用枳實(shí)導(dǎo)滯丸加減比服用枸櫞酸莫沙比利分散片聯(lián)合麻仁丸效果更優(yōu)，且復(fù)發(fā)率更低。王浩[5]通過隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明，使用枳術(shù)丸可以改善老年STC患者的便秘癥狀和生活質(zhì)量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生白術(shù)可以通過提高大鼠結(jié)腸組織c-Kit mRNA表達(dá)，修復(fù)結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞，恢復(fù)結(jié)腸平滑肌的收縮性，促進(jìn)蠕動(dòng)[6]；另外，枳實(shí)揮發(fā)油中的D-檸檬烯可通過調(diào)節(jié)腸道菌群達(dá)到治療STC的效果[7]。研究還發(fā)現(xiàn)，枳術(shù)丸可通過提高小鼠結(jié)腸組織中PLC-γ1與PLC-γ2蛋白和mRNA表達(dá)，有效促進(jìn)其胃腸道運(yùn)動(dòng)，改善便秘癥狀[8]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)篩選結(jié)果顯示，枳術(shù)丸中主要活性成分為木犀草素、柚皮素、川陳皮素、異橙黃酮、3β-白術(shù)乙?；取Ｑ芯勘砻?，木犀草素可通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，從而減少一氧化氮(NO)產(chǎn)生[9]。NO可進(jìn)入胃腸道平滑肌細(xì)胞，抑制結(jié)腸平滑肌收縮，使結(jié)腸運(yùn)動(dòng)變得緩慢，導(dǎo)致STC發(fā)生[10]。腸道微生物紊亂被認(rèn)為是功能性胃腸道疾病的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，而柚皮素對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有良好的抑菌作用[11]。川陳皮素可雙向調(diào)節(jié)小腸平滑肌的收縮性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可顯著提高小腸組織中的肌球蛋白磷酸化，上調(diào)肌球蛋白輕鏈激酶 mRNA和蛋白表達(dá)[12]。

本研究結(jié)果表明，枳術(shù)丸治療STC的靶點(diǎn)主要集中在AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、TP53。MAPK是由多個(gè)蛋白質(zhì)組成的一個(gè)復(fù)雜通路，對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[13]。MAPK對(duì)水通道蛋白(AQPs)在細(xì)胞中的表達(dá)有著調(diào)節(jié)作用，而AQPs主要分布于參與水分吸收和傳輸?shù)慕M織當(dāng)中，起著促進(jìn)調(diào)節(jié)水分運(yùn)輸?shù)淖饔肹14]。馬雪巍等[15]發(fā)現(xiàn)，AQP3在便秘大鼠結(jié)腸近端組織的表達(dá)較正常大鼠明顯提高，并且抑制AQP3表達(dá)可減少結(jié)腸對(duì)于水分的吸收。AKT1、RELA、TP53可能對(duì)腸道動(dòng)力學(xué)發(fā)揮作用，但目前研究較少，機(jī)制不明確。

GO分析發(fā)現(xiàn)，枳術(shù)丸調(diào)治STC的BP主要富集在細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、對(duì)輻射的反應(yīng)、對(duì)UV的反應(yīng)等。KEGG分析結(jié)果顯示，枳術(shù)丸治療STC的主要通路為IL-17信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路。研究表明，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以調(diào)節(jié)炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-8)的產(chǎn)生和釋放；而TNF-α可誘導(dǎo)NO產(chǎn)生，影響微循環(huán)及胃腸道平滑肌的運(yùn)動(dòng)[16]。IL-17信號(hào)通路及相關(guān)的IL-17家族(IL-17A～F)參與炎癥、自身免疫、感染等方面的調(diào)控。研究表明，IL-17A可誘導(dǎo)iNOS和環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達(dá)[17]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)結(jié)腸不完全機(jī)械性腸梗阻大鼠梗阻近端擴(kuò)張的平滑肌細(xì)胞收縮能力明顯下降時(shí)，其COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上升；COX-2基因缺陷小鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能受影響程度較小，抑制COX-2表達(dá)可恢復(fù)平滑肌的收縮功能[18]。

本研究表明，枳術(shù)丸通過多種成分、多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路發(fā)揮治療作用。但是，由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)其本身的局限性和中藥成分、疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)信息收集不全面，以及不同藥物在體內(nèi)相互作用機(jī)制不明確等因素，本研究結(jié)果將進(jìn)行后續(xù)臨床觀察進(jìn)一步驗(yàn)證。