經(jīng)頸動(dòng)脈、尾靜脈骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療慢性腎臟病大鼠效果對(duì)比觀察

萬(wàn)珊杉，馬逸群，吳思穎，簡(jiǎn)遠(yuǎn)熙，楊帆，張文卿，王麗娟，王家平

1云南昆鋼醫(yī)院 大理大學(xué)第七附屬醫(yī)院，昆明650300；2昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院

慢性腎臟病(CKD)是各種腎臟疾病的終末階段，尚缺乏有效的治療手段[1]。多項(xiàng)研究證實(shí)，具有多向分化潛能的干細(xì)胞具有向受損組織、器官趨化的潛能，可以高度增殖，被認(rèn)為是促進(jìn)組織再生修復(fù)、治療全身疾病的潛力治療方法[2]。目前針對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的研究較多，然而不同方式移植BMSC對(duì)CKD的治療效果有所差異。2019年3～10月，本研究對(duì)比觀察了經(jīng)頸動(dòng)脈、尾靜脈BMSC移植治療CKD大鼠的效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠122只，其中4周齡大鼠2只，體質(zhì)量(55±5)g，用于BMSC制備；14周齡大鼠120只，體質(zhì)量(320±20)g，用于治療實(shí)驗(yàn)觀察。阿霉素購(gòu)自Sigma公司，胎牛血清、L-DMEM、PBS緩沖液購(gòu)自Gibco公司，PE10導(dǎo)管購(gòu)自福州賽思生物有限公司，造影劑購(gòu)自辰欣藥業(yè)有限公司。Siemens AXIOM-Artist DSA機(jī)，日立7170A型全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 BMSC的分離、培養(yǎng) 將2只4周齡SD大鼠脫頸處死，大鼠置于乙醇溶液中浸泡5 min，取股骨和脛骨，充分分離肌肉組織，剪去兩側(cè)干骺端，用PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液于50 mL離心管中，以1 000 r/min離心5 min。倒掉上清液，用完全培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞后接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，此后每2～3 d換液1次，10 d后傳代。取第4～6代細(xì)胞備用。BMSC混懸液置于4 ℃保存，將細(xì)胞自冰箱取出到入體時(shí)間間隔控制在2 h內(nèi)。

1.3 模型制作與分組處理 120只大鼠中，30只大鼠不制作模型，為正常組。90只大鼠按照楊維娜等[3]的方法建立CKD模型，模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4]。將造模成功后的大鼠隨機(jī)分為頸動(dòng)脈組、尾靜脈組和生理鹽水組各30只。造模成功后的大鼠術(shù)前禁食8 h。頸動(dòng)脈組采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定；自甲狀軟骨下緣沿正中線偏左0.5 cm處做切口，分離暴露舌骨肌群；于氣管左側(cè)打開頸動(dòng)脈鞘，分離左頸總動(dòng)脈2 cm，穿兩根絲線備用；結(jié)扎遠(yuǎn)端縫合線，將動(dòng)脈下的近心端縫合線提起，鑷柄平托分離動(dòng)脈段，用顯微剪在頸總動(dòng)脈上做“V”形切口；X線透視下將導(dǎo)管送入左頸總動(dòng)脈，經(jīng)主動(dòng)脈弓、降主動(dòng)脈到達(dá)腹主動(dòng)脈；造影確定導(dǎo)管位于腎動(dòng)脈開口處，輸注2 mL混懸液，BMSC總數(shù)2×106個(gè)。尾靜脈組采用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，進(jìn)行尾靜脈穿刺，向尾靜脈注射BMSC，劑量同頸動(dòng)脈組。生理鹽水組經(jīng)頸動(dòng)脈插管輸注等量生理鹽水。

1.4 大鼠生存情況觀察 術(shù)后密切觀察大鼠的生命體征、活動(dòng)狀態(tài)及毛發(fā)顏色。注意大鼠保暖，給予充足的飲用水和飼料，及時(shí)更換墊料。每日記錄各組大鼠體質(zhì)量變化、腹瀉情況及有無(wú)腹水。

1.5 腎功能指標(biāo)監(jiān)測(cè) 收集各組術(shù)后1、7、14 d的24 h尿液離心去除沉淀，在全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)24 h尿蛋白。采集大鼠眼內(nèi)眥靜脈血，獲得血清，在全自動(dòng)生化分析儀中檢測(cè)肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白蛋白。

1.6 腎組織病理觀察 各組大鼠于術(shù)后15 d脫頸處死并取腎臟，多聚甲醛固定并經(jīng)乙醇梯度脫水后采用石蠟包埋，將標(biāo)本用石蠟切片機(jī)切成6 μm厚度切片。脫蠟后蘇木精染色3 min，水沖洗后再用伊紅染色1 min，中性樹膠封片，鏡下觀察腎組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存情況 頸動(dòng)脈組、尾靜脈組、生理鹽水組大鼠均于術(shù)后2～3 h蘇醒，術(shù)后6 h左右基本清醒，術(shù)后24 h可正?；顒?dòng)及進(jìn)食，手術(shù)切口于術(shù)后3～4 d愈合，未發(fā)現(xiàn)切口感染。各組大鼠均存活。頸動(dòng)脈組、尾靜脈組、生理鹽水組大鼠于注射阿霉素后第4天陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉，第14天開始出現(xiàn)腹水。經(jīng)BMSCs移植治療后，頸動(dòng)脈組與尾靜脈組食欲較生理鹽水組旺盛，體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，毛發(fā)較光滑；生理鹽水組明顯食欲不佳，毛發(fā)毛糙，體質(zhì)量增長(zhǎng)較慢。

2.2 各組腎功能指標(biāo)比較 由表1可見，頸動(dòng)脈組、尾靜脈組術(shù)后7、14 d血BUN和24 h尿蛋白量、血清白蛋白水平逐漸降低，Cr呈增高趨勢(shì)(P均<0.05)。頸動(dòng)脈組、尾靜脈組術(shù)后14 d血BUN、Cr、24 h尿蛋白量低于生理鹽水組，血清白蛋白水平高于生理鹽水組;頸動(dòng)脈組術(shù)后14 d血BUN、Cr、24 h尿蛋白量低于尾靜脈組，血清白蛋白水平高于尾靜脈組(P均<0.05)。

表1 各組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)血BUN、Cr、白蛋白、24 h尿蛋白水平比較

2.3 各組腎組織病理變化比較 正常組腎小球、腎小管和腎間質(zhì)未見明顯病理改變(圖1a)。生理鹽水組可見腎小球系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞不同程度增生，腎間質(zhì)有局灶纖維化，可見萎縮腎小管，部分腎小管出現(xiàn)空泡變性征象，腎小球出現(xiàn)局灶節(jié)段性硬化，部分腎小管上皮細(xì)胞脫落(圖1b)。頸動(dòng)脈組腎小球、腎小管改變較生理鹽水組明顯改善，腎間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小管擴(kuò)張，且腎小管無(wú)明顯萎縮，腎間質(zhì)纖維化不明顯，較少出現(xiàn)炎細(xì)胞(圖1c)。尾靜脈組較生理鹽水組腎小球無(wú)明顯黏連，腎小球毛細(xì)血管襻擴(kuò)張(圖1d)。

注：1a為正常組；1b為生理鹽水組；1c為頸動(dòng)脈組；1d為尾靜脈組。

3 討論

CKD是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題，具有高致殘率和高病死率[5]。再生醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展為腎臟疾病的治療提供了新的手段[6]。BMSC是一類來(lái)源于骨髓的、具有高度自我更新能力和多分化能的多能干細(xì)胞。BMSCs具有免疫調(diào)節(jié)能力，在一定誘導(dǎo)條件下，BMSC在體內(nèi)外均可分化為成骨、軟骨、脂肪、心肌、神經(jīng)等組織，可定向遷移至損傷或炎癥部位，改善組織學(xué)損傷程度，并增強(qiáng)受損器官功能[7]。另外，BMSC不會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)性增生，所以不會(huì)引起異體免疫排斥[8]。由于BMSC具有自我更新特性、免疫原性低、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、不涉及倫理道德問題、易于轉(zhuǎn)染外源基因及可多向分化等特點(diǎn)，BMSC移植成為一種治療腎病非常具有前景的方法，并日益得到重視。

向CKD動(dòng)物模型輸注干細(xì)胞是常用的實(shí)驗(yàn)步驟，傳統(tǒng)采用操作簡(jiǎn)單的經(jīng)尾靜脈注射法缺點(diǎn)是難以確定經(jīng)靜脈循環(huán)到達(dá)雙腎干細(xì)胞的具體劑量，只能粗略估計(jì)輸注至大鼠體內(nèi)的總量，難以通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精準(zhǔn)獲得干細(xì)胞治療CKD所需劑量[9]。選擇靶器官血管(腎動(dòng)脈)注射的方法，在實(shí)踐過(guò)程并不可行，動(dòng)物常因無(wú)法止血而死亡。有學(xué)者[10]報(bào)道了經(jīng)左側(cè)頸動(dòng)脈插管、開腹后將腸管取出，用棉簽輔助導(dǎo)管插管進(jìn)入腎動(dòng)脈進(jìn)行靶向注射的方法，但該方法在實(shí)踐中操作困難，實(shí)驗(yàn)完成后大鼠可能因腹腔感染、腸梗阻等原因死亡。結(jié)合臨床常用介入手術(shù)材料自制新型導(dǎo)管應(yīng)用于大鼠實(shí)驗(yàn)亦可見報(bào)道[11]，但實(shí)踐難度略高，需結(jié)合大量操作經(jīng)驗(yàn)和反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能普及。

本實(shí)驗(yàn)選用的頸動(dòng)脈輸注干細(xì)胞的方法結(jié)合并改良了其他實(shí)驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)[12,13]，我們選擇經(jīng)介入手術(shù)穿刺后靶向插入導(dǎo)管，在腎動(dòng)脈開口處輸注BMSC，至腹主動(dòng)脈水平，導(dǎo)管管徑與大鼠腹主動(dòng)脈管徑大致相同，由于順血流方向，絕大部分BMSC將流入雙側(cè)腎動(dòng)脈。在無(wú)需開腹前提下，此法可視為較為精準(zhǔn)而損傷小的干細(xì)胞靶向輸注方法。為提高大鼠術(shù)后存活率，操作中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：將導(dǎo)管尖端剪一斜口，在操作中應(yīng)使尖端稍向內(nèi)側(cè)，避免損傷血管壁造成血腫或大出血；當(dāng)導(dǎo)管前端到達(dá)主動(dòng)弓時(shí)，很容易誤入升主動(dòng)脈造成導(dǎo)管盤入心臟發(fā)生意外，當(dāng)阻力明顯時(shí)可退回稍加旋轉(zhuǎn)，使導(dǎo)絲彎頭彎向左，這樣導(dǎo)管能順勢(shì)進(jìn)入降主動(dòng)脈；操作過(guò)程中為減少出血，助手可用止血鉗輕輕鉗夾靠近心臟部分血管，為插管暴露清晰視野；術(shù)中在大鼠身下墊一恒溫毯保暖，有助于大鼠術(shù)后恢復(fù)；游離頸總動(dòng)脈長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中會(huì)使血管壁緊貼導(dǎo)管，使導(dǎo)管進(jìn)退時(shí)損傷、撕裂血管，可用生理鹽水浸泡后的濕紗布覆蓋切口，保持濕潤(rùn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)BMSC移植治療后，頸動(dòng)脈組與尾靜脈組食欲較生理鹽水組旺盛、體質(zhì)量增長(zhǎng)較快、毛發(fā)較光滑，而生理鹽水組明顯食欲不佳、毛發(fā)毛糙、體質(zhì)量增長(zhǎng)較慢，表明BMSC移植后起到一定效果，大鼠生存情況良好。我們分別于術(shù)后1、7、14 d檢測(cè)各組血BUN、Cr、24 h尿蛋白、血清白蛋白，結(jié)果顯示，頸動(dòng)脈組、尾靜脈組術(shù)后14 d血BUN、Cr、24 h尿蛋白量低于生理鹽水組，血清白蛋白水平高于生理鹽水組，其中，頸動(dòng)脈組術(shù)后14 d血BUN、Cr、24 h尿蛋白量低于尾靜脈組，血清白蛋白水平高于尾靜脈組，這提示頸動(dòng)脈組治療效果較尾靜脈組更具優(yōu)勢(shì)。在腎組織病理變化方面，頸動(dòng)脈組和尾靜脈組腎組織病理變化較生理鹽水組減輕，其中頸動(dòng)脈組腎小球、腎小管病變較生理鹽水組明顯改善，尾靜脈組較生理鹽水組腎小球無(wú)明顯黏連，腎小球毛細(xì)血管襻擴(kuò)張，進(jìn)一步驗(yàn)證了BMSC移植的確切療效。

結(jié)合上述結(jié)果，我們認(rèn)為，經(jīng)頸動(dòng)脈和尾靜脈BMSC移植治療CKD大鼠均成功、有效，且經(jīng)頸動(dòng)脈BMSC移植效果優(yōu)于經(jīng)尾靜脈途徑。我們推測(cè)，這與BMSC靶向到達(dá)腎臟修復(fù)損傷細(xì)胞有一定關(guān)系。經(jīng)尾靜脈輸注干細(xì)胞，細(xì)胞會(huì)隨大鼠的血液循環(huán)流向全身，難以估計(jì)最終到達(dá)腎臟的干細(xì)胞數(shù)量。若能靶向輸注干細(xì)胞至腎臟，將提高研究準(zhǔn)確性及治療效率，令研究結(jié)果更為可靠。因此，改良的經(jīng)頸動(dòng)脈靶向輸注BMSC法在大鼠存活率及提高實(shí)驗(yàn)效率方面具有一定優(yōu)勢(shì)。