東北黑土旱田改稻田對土壤團聚體微生物群落功能多樣性的影響

趙美純 李 鑫 王 月 趙漢丞 趙冬雪 王盼盼 孫廣玉,*

(1 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000；2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000；3 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150000)

東北黑土是我國珍貴的土壤資源，在確保國家糧食安全方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。近些年，受環(huán)境和人為等因素的影響，黑土旱田作物的單位面積產(chǎn)值下降，效益降低，因此農(nóng)民將旱田改為收益較高的稻田(簡稱“旱改稻”)，黑土稻田種植面積大幅增加，提高了單位面積土地的效益。但這種土地利用類型的轉(zhuǎn)變改變了土壤養(yǎng)分的利用途徑，影響土壤中的生物活性和各種理化特性，也改變了土壤微生物群落功能的多樣性，導(dǎo)致土壤肥力水平發(fā)生變化[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，“旱改稻”改變了黑土土壤微生物類群數(shù)量和土壤酶活性，其中土壤中真菌和放線菌數(shù)量在土壤改種后的前5年呈下降趨勢，5年后則呈上升趨勢[5]。且“旱改稻”的前3年土壤有機碳(soil organic carbon, SOC)和全氮含量均下降，4～25年則呈增加的趨勢[6]。土壤團聚體作為土壤的基本結(jié)構(gòu)單位，影響土壤微生物的分布與活性，土壤團聚體中的有機碳是土壤團聚體形成的重要膠結(jié)物質(zhì)，已有研究發(fā)現(xiàn)，土地利用類型改變了土壤團聚體結(jié)構(gòu)和土壤的穩(wěn)定性[7-8]。不同粒徑土壤團聚體的分布、大小和組成不同，影響了土壤團聚體內(nèi)部空氣和水分的分布，直接影響了土壤團聚體內(nèi)微生物與環(huán)境間的物質(zhì)和能量交換，導(dǎo)致土壤團聚體微生物的分布有較大的差異，也影響了團聚體中微生物群落結(jié)構(gòu)不同[9-11]。

目前，國內(nèi)外較多學(xué)者研究了“旱改稻”對耕層土土壤物理化學(xué)、土壤結(jié)構(gòu)以及土壤養(yǎng)分等方面的影響[12-13]。但“旱改稻”對耕層土中土壤團聚體變化以及團聚體內(nèi)土壤微生物功能水平等方面的研究卻鮮見報道，關(guān)于“旱改稻”后黑土土壤團聚體內(nèi)部的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，以及土壤團聚體內(nèi)部對養(yǎng)分利用狀況等尚不清楚。為此，本不采用Biolog-Eco微平板技術(shù)，研究“旱改稻”對土壤團聚體微生物群落多樣性的影響，以期為東北黑土區(qū)土壤可持續(xù)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地位于黑龍江省哈爾濱市民主鄉(xiāng)黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田(45°49′N，126°50′E)，土壤類型為黑土。該區(qū)域?qū)儆跍貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候，年平均氣溫3.1℃，七月平均氣溫20℃，年平均降水量569.1 mm，7—9月份西北季風(fēng)降水量接近59%，無霜期150 d。

1.2 試驗設(shè)計

以旱田玉米土壤為對照組，以旱田改種30年以上稻田土壤為處理組。在旱田和稻田分別布置3個方形區(qū)域(10 m×10 m)，于2017年4月在樣地內(nèi)采用“S”形布點法設(shè)置5個樣點，分別采集旱田和稻田0～20 cm土層土壤樣品，并將每個樣地采集的5個樣品混合均勻，取3次重復(fù)。剔除石塊和根系殘留后將土樣裝入無菌的封口袋中并用冰盒暫時存放帶回實驗室，4℃冰箱中保存。

1.3 測定項目與方法

土壤團聚體的分級采用濕篩法[14-15]。將采集的土壤樣品打碎至<4 mm后，取50 g土樣浸入一套裝有去離子水(4℃)嵌套的篩子(250和53 μm)中，垂直震蕩頻率為25次·min-1。緩慢收集每個篩子上保留的團聚體，分別獲得大團聚體(>250 μm)和微團聚體(53～250 μm)；剩余部分經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min后收集淤泥+粘土部分(<53 μm)。團聚體細分為：旱田大團聚體、旱田微團聚體、旱田淤泥+粘土、稻田大團聚體、稻田微團聚體和稻田淤泥+粘土6種。

團聚體內(nèi)土壤有機碳(SOC)含量的測定采用重鉻酸鉀外容量-加熱法[16]，由于黑土中不含有碳酸鹽，因此土壤總碳即為SOC。土壤團聚體內(nèi)總氮(total nitrogen，TN)含量的測定采用凱氏定氮法[16]。

土壤微生物群落功能多樣性的測定采用Biolog-Eco平板技術(shù)[17]。Biolog-Eco平板含有31種碳源，根據(jù)碳源中碳水化合物官能團類型將31種碳源劃分為六大類：胺類、氨基酸、羧酸、雙親化合物、聚合物和糖類，每個Biolog-Eco板有3次重復(fù)。稱取4℃保存的烘干土約10 g，置于250 mL三角瓶中，加入90 mL去離子水，制成10%(m∶v)的土壤懸浮液，漩渦震蕩1 min，冰浴1 min，重復(fù)3次。冰浴靜置3 min后，轉(zhuǎn)移至無菌操作臺進行梯度操作：吸取2 mL懸液加入18 mL去離子水，在試管中混勻制成1%(m∶v)梯度的土懸液，同樣的方法稀釋至0.1%(m∶v)。將Biolog-Eco板預(yù)熱至25℃，用8道排槍移液器吸取150 μL提取液至各孔中，對照孔加入150 μL無菌水。25℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、24、48、72、96、120、144、168、192、216和240 h時，用Sunrise酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)在590 nm波長處測定光度值。土壤微生物群落的平均顏色變化率(average well color development，AWCD)是反映土壤微生物代謝強度的重要指標(biāo)；Shannon指數(shù)(H)用于評估微生物的豐富度；Simpson指數(shù)(D)用于評估優(yōu)勢度；McIntosh指數(shù)(U)用于評估基于群落物種多維空間上Eu-clidian距離的多樣性[18-20]，均根據(jù)公式計算：

AWCD=∑(Ci-R)/n

(1)

H=-∑(PilnPi)

(2)

D=1-∑(Pi)2

(3)

(4)

式中，Ci為第i個碳源孔的光密度值；R為對照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基的碳源種類數(shù)目，本研究中為31；Pi為有培養(yǎng)基的孔與對照孔的光密度值差與整板總差的比值；ni為第i孔的光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010處理和作圖，采用SPSS Statistics 17.0軟件進行多重比較和主成分分析，采用Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗，采用Person相關(guān)系數(shù)表示相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 “旱改稻”對土壤水穩(wěn)性團聚體分布、團聚體內(nèi)有機碳和總氮含量的影響

由表1可知，旱田和稻田中微團聚體(53～250 μm)所占比例最大，而大團聚體(>250 μm)所占比例最小。“旱改稻”后土壤微團聚體占比例超過50%，且顯著高于旱田土壤，而大團聚體和淤泥+粘土(<53 μm)雖然略低于旱田，但差異未達到顯著水平。

由圖1可知，“旱改稻”明顯影響了土壤團聚體內(nèi)SOC和TN含量。與旱田相比，稻田土壤中的SOC含量顯著增加(P<0.05)，但TN含量變化不顯著(P>0.05)。旱田和稻田土壤團聚體內(nèi)的SOC和TN含量均隨著團聚體粒徑的減小而降低，即大團聚體>微團聚體>淤泥+粘土。

注：不同大寫字母表示旱田與稻田之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示3種團聚體粒徑之間差異顯著(P<0.05)。Note: Different capital letters indicate significant difference between the upland and paddy tillage at 0.05 level. Different lowercase letters indicate significant difference among particle size in three classes of isolated soil aggregate at 0.05 level.圖1 旱田與稻田的不同粒徑水穩(wěn)性團聚體SOC和TN含量(n=3)Fig.1 The contents of SOC and TN in different particle size of all water-stable aggregates of upland and paddy tillage treatments (n=3)

表1 旱田與稻田的土壤水穩(wěn)性團聚體粒徑分布比例Table 1 Water-stable aggregate size distribution percentage of upland and paddy tillage /%

2.2 “旱改稻”對不同粒徑土壤水穩(wěn)性團聚體微生物平均顏色變化率的影響

注：UMAA：旱田大團聚體；UMIA：旱田微團聚體；USCF：旱田淤泥+粘土；PMAA：稻田大團聚體；PMIA：稻田微團聚體；PSCF：稻 田淤泥+粘土。下同。Note: UMAA: Macro-aggregates in upland . UMIA: Micro-aggregates in upland. USCF: Silt + clay aggregates in upland. PMAA: Macro-aggregates in paddy tillage. PMIA: Micro-aggregates in paddy tillage. PSCF: Silt + clay aggregates in paddy tillage. The same as following.圖2 不同粒徑土壤團聚體微生物群落AWCD隨培養(yǎng)時間的變化Fig.2 Changes in AWCD of microbial community in particle size soil aggregates with cultural time

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)0～216 h過程中，旱田和稻田各粒徑土壤團聚體微生物利用碳源的總量呈逐漸增加的趨勢，且旱田和稻田不同粒徑土壤團聚體微生物群落的AWCD增長幅度不同，說明各粒徑土壤團聚體內(nèi)微生物群落對碳源的利用能力存在差異，反映了各粒徑土壤團聚體微生物群落組成的差異，這可能與土地種植作物改變，返還土壤中的養(yǎng)分不同有關(guān)。在培養(yǎng)24 h內(nèi)，各粒徑土壤水穩(wěn)性團聚體微生物群落的AWCD無明顯變化；培養(yǎng)24 h后，各粒徑土壤團聚體微生物群落的AWCD快速提高，至培養(yǎng)96 h時，生長較緩慢的微生物均已參與碳源的代謝。與旱田相比，稻田土壤不同粒徑團聚體中土壤微生物群落的AWCD在培養(yǎng)96 h時基本處于穩(wěn)定，碳源利用能力達到相對穩(wěn)定階段用時較短，說明稻田土壤具有較高的碳螯合效率。在培養(yǎng)216～240 h期間，旱田大團聚體和微團聚體呈下降趨勢，可能是因為沒有足夠碳源可以被各粒徑團聚體中的微生物利用或者各粒徑團聚體微生物對碳源的利用能力減弱。總體來看，旱田和稻田各粒徑土壤團聚體微生物群落的AWCD變化幅度為：旱田淤泥+粘土>旱田大團聚體>旱田微團聚體>稻田大團聚體>稻田淤泥+粘土>稻田微團聚體，旱田團聚體微生物對碳源的利用程度均高于稻田，說明旱田團聚體微生物活性和物種豐富度高于稻田，且旱田和稻田中均以微團聚體微生物對碳源的利用能力最低。

2.3 “旱改稻”對土壤團聚體微生物群落利用碳源多樣性指數(shù)的影響

表4 旱田與稻田土壤團聚體微生物對不同碳源的利用Table 4 Utilization of different carbon sources by soil microorganisms in soil aggregates in upland and paddy tillage

由圖2可知，土壤微生物在培養(yǎng)96 h時，生長較緩慢的微生物均已參與碳源的代謝，因此選用此時的Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)和Simpson指數(shù)分別用于評估微生物群落中物種的豐富度、優(yōu)勢度和均勻度，結(jié)果如表2所示。在旱田土壤團聚體微生物中，大團聚體微生物的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均低于淤泥+粘土微生物，而McIntosh指數(shù)高于淤泥+粘土微生物，而微團聚體中微生物的各指數(shù)均最低。在稻田土壤團聚體微生物中，大團聚體微生物的Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)和Simpson指數(shù)均最高。通過雙因素方差分析表明(表3)，土地利用類型和團聚體粒徑極顯著影響McIntosh指數(shù)；土地利用類型對Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)具有極顯著影響，且稻田各粒徑團聚體微生物的多樣性指數(shù)均低于旱田相應(yīng)粒徑團聚體微生物。

表2 旱田與稻田土壤團聚體微生物AWCD與多樣性指數(shù)Table 2 Microbial AWCD and diversity index in soil aggregates of upland and paddy tillage

表3 土地利用類型、團聚體粒徑以及交互作用對McIntosh、Shannon和Simpson指數(shù)的影響Table 3 The effects of used land type, soil aggregates and their interaction on McIntosh、Shannon and Simpson index

2.4 “旱改稻”對土壤團聚體微生物利用6種碳源強度的影響

由表4可知，“旱改稻”降低了土壤團聚體微生物對氨基酸、羧酸、酚酸類化合物、多聚合化合物和碳水化合物的利用強度。在大團聚體中，旱田對氨基酸和碳水化合物的利用強度極顯著高于稻田(P<0.01)，分別是稻田的1.30和14.16倍；在微團聚體中，旱田對氨基酸、羧酸、酚酸類化合物、多聚合化合物和碳水化合物的利用強度均極顯著高于稻田(P<0.01)，分別是稻田的64.50、31.29、59.00、2.81和47.71倍；在淤泥+黏土中，旱田對氨基酸、酚酸類化合物、多聚合化合物和碳水化合物的利用強度均極顯著高于稻田(P<0.01)，分別是稻田的304.5、7.08、4.21和83.67倍。

在旱田土壤團聚體中，大團聚體和淤泥+粘土微生物對氮基酸、羧酸和碳水化合物的利用強度高。微團聚體微生物對碳源的利用強度均最低。在稻田土壤團聚體中，大團聚體微生物對碳源的利用強度最高，其次為淤泥+粘土，微團聚體微生物對碳源利用程度最低。

對于胺類碳源，土壤微生物對其利用程度均接近為0，說明土壤微生物對此類碳源利用較少。

2.5 “旱改稻”對土壤團聚體微生物群落利用碳源主成分分析

主成分分析采用降維的方法，在31個因子中提取了3個主成分因子，分別解釋所有變量方差的26.82%、20.35%和11.72%，主成分1和主成分2的累積貢獻率達47.17%，是變異的主要來源，可以解釋變量的絕大部分信息。由圖3可知，旱田淤泥+粘土位于PC1的正端，稻田淤泥+粘土位于PC1的負端；旱田微團聚體多集中于PC2負端，稻田微團聚體多集中于PC2正端，說明旱田與稻田土壤團聚體微生物群落對碳源的利用具有一定差異。總體而言，旱田和稻田微生物的生理代謝功能差異明顯，PC1與PC2基本上能夠區(qū)分旱田和稻田各粒徑土壤團聚體微生物群落的代謝特征。

圖3 不同處理下土壤微生物群落利用碳源的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of carbon utilization in soil microbial communities under different treatments

由表5可知，與PC1顯著相關(guān)的碳源共16種，包括6種氨基酸、2種羧酸、2種酚酸類化合物、6種碳水化合物，說明這16種碳源導(dǎo)致旱田和稻田各粒徑土壤團聚體微生物群落代謝功能多樣性在PC1存在顯著差異。與PC2顯著相關(guān)的碳源有9種，包括1種胺類、1種氨基酸、4種羧酸、1種多聚合化合物、2種碳水化合物，說明這9種碳源導(dǎo)致旱田和稻田各粒徑土壤團聚體微生物群落代謝功能多樣性在PC2存在顯著差異。

3 討論

本研究結(jié)果表明，在土壤水穩(wěn)性團聚體粒徑分布比例中，“旱改稻”后大團聚體和淤泥+粘土含量均降低，但微團聚體含量卻顯著增加。大團聚體由易降解和水溶解態(tài)有機質(zhì)來控制，在“旱改稻”過程中，由于土層結(jié)構(gòu)被破壞，土粒間粘合力下降，大團聚體破碎為微團聚體，導(dǎo)致水穩(wěn)性大團聚體分布比例降低[21]；而微團聚體是由多價陽離子橋和多糖形成，通過分子力與土壤顆粒表面的多價陽離子結(jié)合形成有機、無機復(fù)合體，然后與其他土壤顆粒粘結(jié)，形成穩(wěn)定的微團聚體[21-22]。因此當(dāng)土層被破壞后，多價陽離子凝聚，與作物根系上的多糖和粘粒間形成陽離子鍵橋，增加微團聚體粒徑分布比例并增加微團聚體穩(wěn)定性[22]；但由于淤泥+粘土的SOC和TN含量較低，沒有足夠的膠結(jié)物質(zhì)和養(yǎng)分形成團聚體，使“旱改稻”后土壤淤泥+粘土分布比例降低[23]。本研究結(jié)果表明東北黑土團聚體可能以53～250 μm粒徑的微團聚體為主。

旱田和稻田團聚體內(nèi)SOC和TN含量均隨著團聚體粒徑的減小而降低。有研究表明，大團聚體主要由較低層次的團聚體與有機物質(zhì)等膠結(jié)組成，大團聚體與小團聚體相比含有更多的SOC[24-25]。本研究結(jié)果顯示，稻田中的SOC含量顯著高于旱田，TN含量低于旱田，可能是由于“旱改稻”后，稻田土壤存在季節(jié)性淹水，稻田環(huán)境可以保護活性碳庫不被快速分解，因此稻田SOC含量高于旱田[26]；但由于稻田作物固氮能力低于旱田作物，且稻田的季節(jié)性淹水導(dǎo)致土壤通氣狀況差，土壤硝化作用受到抑制，影響氮循環(huán)過程，因此稻田中TN含量低于旱田[27]。

表5 31種碳源與 PC1、PC2的相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation coefficients of 31 sole-carbon sources with PC1 and PC2

本研究旱田和稻田不同粒徑土壤團聚體微生物利用碳源的總量在培養(yǎng)時間為0～216 h過程中呈逐漸增加趨勢，表明土壤微生物群落代謝活性增強，培養(yǎng)216 h后進入穩(wěn)定期。本研究微生物代謝活性進入穩(wěn)定期的時間要長于張志浩等[28]和張志政等[29]研究，可能由研究區(qū)域氣候條件不一致導(dǎo)致土壤微生物活性存在差異引起的；其次，由于黑土的自身環(huán)境，微生物種類更豐富，需要充足的時間進行培養(yǎng)，保證全部微生物利用碳源。隨著培養(yǎng)時間的延長，旱田不同粒徑土壤團聚體微生物利用碳源的總量均高于稻田，一方面可能由稻田的水分環(huán)境和厭氧環(huán)境導(dǎo)致[30-31]；另一方面可能是由于稻田存在季節(jié)性淹水，導(dǎo)致團聚體結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，團聚體破碎后會形成較低層次的團聚體[32]，因此旱田和稻田不同粒徑團聚體的含量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響了微生物對碳源的利用。

不同粒徑土壤團聚體對六大類碳源的利用存在一定的差異，“旱改稻”導(dǎo)致土壤各粒徑團聚體微生物對碳源的利用發(fā)生明顯變化。其中，旱田團聚體微生物對碳水化合物、羧酸和氨基酸利用程度高，稻田團聚體微生物對多聚合化合物和羧酸利用程度高，說明“旱改稻”后減少了土壤團聚體中利用碳水化合物和氨基酸的微生物菌群。通過主成分分析進一步證明對PC1和PC2起分異作用的主要碳源為氨基酸、碳水化合物和羧酸。與旱田相比，稻田土壤微生物活性較低，且稻田土壤中的水坑常常破壞土壤結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致土壤團聚體對碳源的利用產(chǎn)生差異[33]；也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)“旱改稻”降低了土壤的pH值，改變了土壤微生物群落，引起土壤中養(yǎng)分利用的變化，因此對碳源種類的利用出現(xiàn)差異[34-35]。

旱田不同粒徑團聚體微生物的Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于稻田，表明旱田土壤團聚體微生物群落物種數(shù)較豐富。其中通氣狀況與水分可能是影響微生物分布最主要的因子，“旱改稻”后土壤水分分布發(fā)生明顯變化，土壤外部通氣狀態(tài)下降，阻礙了微生物的生長與繁殖，抑制了土壤養(yǎng)分的循環(huán)，導(dǎo)致稻田土壤團聚體中微生物的多樣性指數(shù)較低[36-37]。在各粒徑團聚體中，微團聚體群落多樣性指數(shù)最低，對碳源的利用能力較弱，可能是由于微團聚體中含有較多高分子碳水化合物，微生物對其分解能力較弱，且微團聚體參與團聚體的形成作用大于參與養(yǎng)分循環(huán)的作用[38]。

4 結(jié)論

黑土“旱改稻”增加了土壤水穩(wěn)性微團聚體比例，提高了土壤團聚體SOC的含量，降低了土壤各粒徑團聚體內(nèi)微生物群落的多樣性，同時也降低了以氨基酸和碳水化合物為主的土壤微生物利用碳源的能力。為確保東北黑土可持續(xù)利用，后續(xù)可采用高通量測序技術(shù)研究“旱改稻”后土壤中難培養(yǎng)微生物種群變化，以進一步闡明“旱改稻”對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能影響的生物學(xué)機制。