不同氮高效玉米品種對氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝研究

王 健 韓金玲 楊 敏 姚丹丹 周印富 王文頗 吳振興 楊 晴,*

(1 河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066600； 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米與特色旱糧研究所，浙江 金華 322100)

氮是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素[1]。氮肥作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的外源投入品為作物增產(chǎn)增收做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，由于土壤淋溶、微生物消耗和反硝化作用等原因?qū)е碌世寐曙@著下降[2-3]。據(jù)報(bào)道，中國的氮肥利用效率平均約為30%，西方發(fā)達(dá)國家平均約為50%～60%[4]。流失的氮肥會對周圍的生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞，最終影響人類健康[5]。玉米的籽粒產(chǎn)量形成以及籽粒蛋白質(zhì)含量與氮肥的合理施用及氮代謝調(diào)控過程緊密相關(guān)[6-7]。因此，合理利用氮肥是實(shí)現(xiàn)玉米綠色高效豐產(chǎn)的重要舉措。

玉米籽粒氮素大部分來自營養(yǎng)器官中氮素的花后再轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。研究表明，玉米吐絲后氮素向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著增加，同時(shí)，生育后期的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量直接決定著玉米的氮素利用效率和收獲指數(shù)[9]。不同玉米品種吐絲前后的氮素同化能力存在較大差異，這種差異表現(xiàn)在不同品種對氮素的吸收、利用、轉(zhuǎn)運(yùn)和再分配上[10-11]。晁曉樂等[12]研究表明，隨著施氮量的增加，低氮高效型玉米品種潞玉19的氮肥利用效率呈降低趨勢。Yan等[13]研究表明，相較于掖單13，先玉335在吐絲后的干物質(zhì)生產(chǎn)能力更強(qiáng)，秸稈氮素轉(zhuǎn)移效率更高，因此籽粒擁有更高的氮含量。屈佳偉等[14]研究表明，在低氮或適量施氮條件下，相較于氮低效品種內(nèi)單314，氮高效品種鄭單958表現(xiàn)出較高的氮素吸收效率?？梢姡煌蛐推贩N的氮素利用效率存在較大差異。針對不同玉米品種的氮素積累、轉(zhuǎn)運(yùn)及氮素利用率，前人已從品種、基因型、遺傳特性等方面進(jìn)行了大量報(bào)道[15-16]。但有關(guān)不同氮高效型品種的氮素吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究擬以低氮高效型玉米品種京農(nóng)科728和高氮高效型玉米品種先玉335為試材，采取大田試驗(yàn)和溫室盆栽試驗(yàn)，設(shè)置不同的施氮水平，并以冀東地區(qū)生產(chǎn)施肥量為對照，探討減氮條件下玉米植株的氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)效率、氮素同化途徑關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)量在不同生育時(shí)期的演變特征，解析不同氮素需求品種氮肥高效利用的生理調(diào)控機(jī)制及遺傳特征，為全力推進(jìn)化肥減量增效及高效氮利用玉米品種的栽培與選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2018—2019年在河北科技師范學(xué)院昌黎試驗(yàn)站(40°40′N，118°95′E)進(jìn)行。該區(qū)位于河北省東部，屬于暖溫帶、半濕潤大陸性氣候，年均降水量為638.33 mm，年平均氣溫11℃，無霜期為186 d。試驗(yàn)地土壤類型為中壤土。2018年土壤理化性質(zhì)為pH值7.78，含有機(jī)質(zhì)21.54 g·kg-1、全氮1.51 g·kg-1、堿解氮134.67 mg·kg-1、速效磷10.58 mg·kg-1、速效鉀85.02 mg·kg-1；2019年土壤理化性質(zhì)為pH值7.73，含有機(jī)質(zhì)19.08 g·kg-1、全氮1.68 g·kg-1、堿解氮102.35 mg·kg-1、 速效磷23.59 mg·kg-1、速效鉀74.10 mg·kg-1。試驗(yàn)材料選取低氮高效型玉米品種京農(nóng)科728和高氮高效型玉米品種先玉335，購自唐山集強(qiáng)農(nóng)業(yè)科技有限公司，不同氮高效型玉米品種的選取參考周培祿等[17]和王榮煥等[18]的研究結(jié)果。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 田間試驗(yàn) 于2018—2019年在河北科技師范學(xué)院昌黎試驗(yàn)站進(jìn)行氮肥試驗(yàn)。設(shè)置5個(gè)處理，NCK(360 kg·hm-2，本地生產(chǎn)施氮量)、N1(120 kg·hm-2，較NCK減氮66.66%)、N2(180 kg·hm-2，較NCK減氮50.00%)、N3(240 kg·hm-2，較NCK減氮33.33%)、N4(300 kg·hm-2，較NCK減氮16.66%)。氮肥以尿素控制，同時(shí)配施過磷酸鈣(120 kg·hm-2)和氯化鉀(45 kg·hm-2)，肥料均以基肥方式施入。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。均采用井水灌溉以防止灌溉水中養(yǎng)分可能帶來的干擾，其他同高產(chǎn)栽培管理，嚴(yán)格防治病蟲害。玉米成熟采收后，分小區(qū)單收、單曬、單稱，計(jì)算各小區(qū)產(chǎn)量。利用大田試驗(yàn)進(jìn)行氮素含量和氮素代謝相關(guān)酶活性的測定。

1.2.2 溫室盆栽試驗(yàn) 于2019年在河北科技師范學(xué)院昌黎試驗(yàn)場玻璃溫室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)處理設(shè)置與田間試驗(yàn)相同，每個(gè)施氮量處理種植10盆，其中裝盆土壤取自昌黎試驗(yàn)站，為田間試驗(yàn)經(jīng)過施肥處理的0～25 cm土層土壤裝盆，土壤類型為中壤土，每盆土壤15 kg，分別于拔節(jié)期取第6片葉，大喇叭口期取第8片葉，抽雄吐絲期和灌漿期均取第12片葉，用液氮速凍，置于-80℃冰箱，用于基因表達(dá)量的測定。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 氮素含量測定 于玉米主要生育期進(jìn)行群體動態(tài)調(diào)查和取樣，每小區(qū)連續(xù)選取3株具有代表性的植株，拔節(jié)期、大喇叭口期按莖稈、葉片和葉鞘3部分取樣，抽雄吐絲期按莖稈、葉片、葉鞘、雄穗和雌穗5部分取樣，灌漿期和成熟期按莖稈、葉片、葉鞘、雄穗、苞葉、穗軸和籽粒7部分取樣。然后于105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重。采用凱氏定氮法[19]測定玉米植株全氮含量。根據(jù)公式計(jì)算莖稈、葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率和莖稈、葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒氮的貢獻(xiàn)率：

莖稈氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率=(吐絲期莖稈氮含量-成熟期莖稈氮含量)/吐絲期莖稈氮含量×100%

(1)

葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率=(吐絲期葉片氮含量-成熟期葉片氮含量)/吐絲期葉片氮含量×100%

(2)

莖稈氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒氮的貢獻(xiàn)率=(吐絲期莖稈氮含量-成熟期莖稈氮含量)/成熟期籽粒氮含量×100%

(3)

葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒氮的貢獻(xiàn)率=(吐絲期葉片氮含量-成熟期葉片氮含量)/成熟期籽粒氮含量×100%

(4)。

1.3.2 酶活性測定 分別于玉米拔節(jié)期、大喇叭口期、抽雄吐絲期、灌漿期和成熟期取玉米葉片鮮樣測定氮代謝相關(guān)酶活性。根據(jù)楊新泉等[20]的方法測定谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)活性；根據(jù)趙世杰等[21]的方法測定硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)活性；根據(jù)Ozawa等[23]的方法測定亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase，NiR)活性；根據(jù)Górny等[23]的方法測定谷氨酸合成酶(glutamate synthase，GOGAT)活性；根據(jù)王佳[24]的方法測定天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase，AS)活性。

1.3.3 基因表達(dá)量測定 氮代謝相關(guān)酶基因序列通過GeneBank、www.maizegdb.org和www.ncbi.nlm.nih.gov/獲得。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的基因序列利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)基因引物，在NCBI上進(jìn)行引物序列比對，保證其專一性，內(nèi)參基因?yàn)镚ADPH(詳見表1)。采用TaqSYBR?Green qPCR測試盒(TaKaRa，日本)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)。反應(yīng)體系為：10 μL SYBR、0.8 μL上游引物、0.8 μL下游引物、0.4 μL ROX Reference Dye、6 μL 滅菌水，將反應(yīng)體系混勻后加入2 μL稀釋10倍的cDNA模板。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃擴(kuò)增30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔct法計(jì)算目標(biāo)基因相對表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用(SPSS)12.0軟件進(jìn)行SP的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，采用SigmaPlot 12.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮量對玉米氮素利用的影響

2.1.1 施氮量對玉米氮素積累的影響 由表2可知，兩品種氮素積累量均隨著生育期的推進(jìn)呈增加趨勢。高氮高效型品種先玉335氮素積累量在拔節(jié)至抽雄吐絲期呈快速上升趨勢，隨后緩慢增長，灌漿至成熟期又快速增長；低氮高效型品種京農(nóng)科728的氮素積累量在拔節(jié)至大喇叭口期快速增長，隨后緩慢增長，灌漿至成熟期又快速增長。

高氮高效型品種先玉335在各生育時(shí)期氮素積累量對施氮量的響應(yīng)規(guī)律存在差異(表2)。拔節(jié)期、大喇叭口期和抽雄吐絲期，隨著施氮量的增加，先玉335的氮素積累量呈先增加后下降的趨勢，其中，在拔節(jié)期，N3的氮素積累量最高；在大喇叭口期，N4的氮素積累量最高；在抽雄吐絲期，N2的氮素積累量最高，較NCK提高37.81%，且差異達(dá)到顯著水平。灌漿期和成熟期，隨著施氮量的增加，先玉335的氮素積累量呈雙峰曲線，其中，在灌漿期，N4的氮素積累量最高，但各處理間差異未達(dá)到顯著水平；在成熟期，N4的氮素積累量最高，較NCK顯著提高54.87%。隨著施氮量的增加，除灌漿期以外，各生育期的氮素積累量大致呈先升高后降低的趨勢，其中，在成熟期，N2的氮素積累量最高，且顯著高于NCK；在抽雄吐絲期和灌漿期，N3氮素積累量最高，但均與N2差異不顯著。

2.1.2 成熟期玉米不同器官氮素分配 由圖1可知，成熟期，不同施氮量下，兩品種各器官氮素積累量分配規(guī)律大致表現(xiàn)為籽粒>葉片>莖稈>穗軸>葉鞘>苞葉>雄穗，其中籽粒為氮素積累的主要器官，高氮高效型品種先玉335中籽粒氮素積累占全株氮素積累量的64.31%～71.09%，低氮高效型品種京農(nóng)科728中籽粒氮素積累占全株氮素積累量的67.47%～73.17%。

表2 施氮量對玉米不同生育時(shí)期氮素氮素積累的影響

圖1 施氮量對玉米成熟期各器官氮素積累的影響Fig.1 Effects of nitrogen application rate on nitrogen accumulation in maize organs at maturity stage

在高氮高效型品種先玉335中，與NCK相比，N4顯著增加莖稈、葉片和籽粒的氮素積累量(P<0.05)；N3顯著增加葉鞘和雄穗的氮素積累量(P<0.05)。在低氮高效型品種京農(nóng)科728中，與NCK相比，N2顯著增加莖稈、葉鞘、雄穗和籽粒的氮素積累量(P<0.05)；葉片、苞葉和穗軸的氮素積累量在N3達(dá)到最大值，且與NCK差異顯著(P<0.05)。綜上可知，高氮高效型品種先玉335各器官氮素積累量在240～300 kg·hm-2(N3～N4)施氮量之間達(dá)到較高水平，低氮高效型品種京農(nóng)科728各器官氮素積累量在180～240 kg·hm-2(N2～N3)施氮量之間達(dá)到較高水平。

2.1.3 施氮量對玉米氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率以及氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒貢獻(xiàn)率的影響 養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運(yùn)量和轉(zhuǎn)運(yùn)效率是表征營養(yǎng)體養(yǎng)分向籽粒轉(zhuǎn)移量的重要指標(biāo)。由表3可知，隨著施氮量的增加，先玉335莖稈的氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率呈先升高后降低的趨勢，在N4達(dá)到最大值，且顯著高于其他各處理；葉片的氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率總體呈上升的趨勢，在NCK達(dá)到最大值，但與N3、N4差異未達(dá)到顯著水平。隨著施氮量的增加，京農(nóng)科728莖稈的氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率呈先降低后升高的趨勢，在N3達(dá)到最小值，且與N1差異達(dá)到顯著水平；葉片的氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率呈先降低后升高的趨勢，在N2達(dá)到最小值，與NCK差異達(dá)到顯著水平。結(jié)果表明，低氮高效型品種京農(nóng)科728莖稈、葉片的氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率明顯高于高氮高效型品種先玉335。

隨著施氮量的增加，先玉335莖稈氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒的貢獻(xiàn)率呈先升高后降低的趨勢，N4莖稈氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒的貢獻(xiàn)率顯著高于NCK；葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒的貢獻(xiàn)率總體呈升高的趨勢，在NCK達(dá)到最大值，但與N3、N4差異未達(dá)到顯著水平。隨著施氮量的增加，京農(nóng)科728莖稈、葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒的貢獻(xiàn)率均呈先降低后升高的趨勢。結(jié)果表明，低氮高效型品種京農(nóng)科728葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒的貢獻(xiàn)率明顯高于高氮高效型品種先玉335。

表3 施氮量對玉米氮轉(zhuǎn)運(yùn)效率和氮轉(zhuǎn)運(yùn)對籽粒貢獻(xiàn)率的影響

注：A：京農(nóng)科728；B：先玉335，不同小寫字母表示同一時(shí)期不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A: Jingnongke 728. B: Xianyu 335. Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level among treatments at the same. The same as following.圖2 施氮量對玉米硝酸還原酶的影響Fig.2 Effects of nitrogen application on nitrate reductase in maize

2.2 氮代謝相關(guān)酶活性的測定

2.2.1 硝酸還原酶(NR) 由圖2可知，同一施氮水平下，隨著生育期的推移，高氮高效型品種先玉335和低氮高效型品種京農(nóng)科728的NR活性均呈單峰曲線變化，并在大喇叭口期達(dá)到最大值，隨后開始下降。對同一時(shí)期不同施氮量的NR活性進(jìn)行比較，京農(nóng)科728在生育前期不同氮處理間的NR活性無顯著差異；至灌漿期，N4、NCK的NR活性分別較N2顯著提高85.55%和84.87%。而先玉335在拔節(jié)期不同氮處理間的NR活性差異不顯著，隨著生育期的推移，差異逐漸增大；大喇叭口期，N4的NR活性顯著高于其他施氮處理；抽雄吐絲期，N3和N4的NR活性顯著高于NCK。對不同氮高效型品種間葉片的NR活性進(jìn)行比較，總體而言，在中低氮水平(N1、N2)下，低氮高效型品種京農(nóng)科728的NR活性明顯高于高氮高效型品種先玉335，在高氮水平(N3、N4)下，先玉335的NR活性明顯高于京農(nóng)科728。

2.2.2 亞硝酸鹽還原酶(NiR) 由圖3可知，同一施氮水平下，隨著生育期的推移，高氮高效型品種先玉335和低氮高效型品種京農(nóng)科728的NiR活性均呈先雙峰曲線的趨勢，兩品種NiR活性均在大喇叭口期達(dá)到最大值。對同一時(shí)期不同氮處理的NiR活性進(jìn)行比較，京農(nóng)科728的NiR活性在生育后期表現(xiàn)出較大差異，抽雄吐絲期、灌漿期和成熟期，N2的NiR活性顯著高于NCK。先玉335在生育前期不同氮處理間的NiR活性無顯著差異；至抽雄吐絲期，N4的NiR較NCK顯著提高46.32%。對兩品種間葉片的NiR活性進(jìn)行比較，中低氮水平(N1、N2)下，低氮高效型品種京農(nóng)科728的平均NiR活性明顯高于高氮高效型品種先玉335；高氮水平(N3、N4)下，先玉335的NiR平均活性明顯高于京農(nóng)科728。

圖3 施氮量對玉米亞硝酸還原酶的影響Fig.3 Effects of nitrogen application on nitrite reductase in maize

圖4 施氮量對玉米谷氨酰胺合成酶的影響Fig.4 Effects of nitrogen application on glutamine synthetase in maize

2.2.3 谷氨酰胺合成酶(GS) 由圖4可知，同一施氮水平下，不同氮高效型玉米品種的GS活性表現(xiàn)各異。隨著生育期的推移，低氮高效型品種京農(nóng)科728的GS活性呈下降趨勢；高氮高效型品種先玉335的GS活性呈先升高后降低的趨勢。施氮量對京農(nóng)科728不同生育時(shí)期GS活性的調(diào)控存在較大差異，在拔節(jié)期，N2的GS活性顯著高于NCK；在大喇叭口期，N3的GS活性顯著高于其他施氮處理；在抽雄吐絲期，NCK的GS活性最高，且顯著高于其他施氮處理；在灌漿期和成熟期，N4的GS活性顯著高于NCK。隨著施氮量的增加，先玉335的GS活性在各生育時(shí)期總體呈先升高后降低的趨勢；在拔節(jié)期，N2的GS活性顯著高于其他施氮處理；在大喇叭口期、灌漿期和成熟期，N3的GS活性顯著高于其他施氮處理；在抽雄吐絲期，NCK的GS活性最高，但與N3差異未達(dá)顯著水平。

2.2.4 谷氨酸合成酶(GOGAT) 由圖5可知，施氮量對京農(nóng)科728不同生育時(shí)期GOGAT活性的調(diào)控存在較大差異，在拔節(jié)期，N2的GOGAT活性顯著高于其他施氮處理；在大喇叭口期，N4的GOGAT活性顯著高于N1；在抽雄吐絲期，N1的GOGAT活性顯著高于其他施氮處理；在灌漿期，N4的GOGAT活性顯著高于其他施氮處理；在成熟期，N2的GOGAT活性顯著高于其他施氮處理。隨著施氮量的增加，高氮高效型品種先玉335的GOGAT活性在各生育時(shí)期大致呈先升高后降低的趨勢。在拔節(jié)期、抽雄吐絲期和灌漿期，N3的GOGAT活性均最高，分別較NCK顯著提高31.39%、82.63%和87.53%。

圖5 施氮量對玉米谷氨酸合成酶的影響Fig.5 Effects of nitrogen application on glutamate synthase in maize

2.2.5 天冬酰胺合成酶(AS) 如圖6所示，同一施氮水平下，隨著生育期的推移，兩品種的AS活性均呈先降低后升高的趨勢。隨著施氮量的增加，低氮高效型品種京農(nóng)科728各生育時(shí)期的AS活性總體呈先升高后降低的趨勢。在拔節(jié)期，N4的AS活性顯著高于NCK；在大喇叭口期和成熟期，N2的AS活性顯著高于其他施氮處理；在抽雄吐絲期和灌漿期，N3的AS活性顯著高于其他施氮處理。施氮量對高氮高效型品種先玉335不同生育時(shí)期的AS活性影響存在較大差異，在大喇叭口期、抽雄吐絲期和灌漿期，N2的AS酶活性分別較NCK顯著提高62.36%、6.14%和12.17%。

圖6 施氮量對玉米天冬酰胺合成酶的影響Fig.6 Effects of nitrogen application on asparagine synthetase in maize

2.3 氮代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量

對氮代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的測定結(jié)果如圖7、8所示。相較于拔節(jié)期，在大喇叭口期，京農(nóng)科728和先玉335的NR、GOGAT1、GOGAT2基因相對表達(dá)量均顯著上調(diào)，但京農(nóng)科728的NR基因相對表達(dá)量顯著高于先玉335(P<0.05)(圖7)。相較于拔節(jié)期，在抽雄吐絲期和灌漿期，京農(nóng)科728中的GS1-3基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；在灌漿期，先玉335的GS1-3基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)(圖7)。相較于拔節(jié)期，在其他生育期，兩品種的GS1-4基因相對表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，但各生育時(shí)期下調(diào)程度存在差異。隨著生育的推進(jìn)，京農(nóng)科728的GS1-4基因相對表達(dá)量持續(xù)下調(diào)，灌漿期達(dá)到最小值(圖8)。相較于拔節(jié)期，京農(nóng)科728在灌漿期的AS1和AS3基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。相較于拔節(jié)期，先玉335在其他生育期的AS1基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，AS2和AS3基因相對數(shù)量均未發(fā)生顯著變化(圖8)。

2.4 產(chǎn)量

由表3可知，2018年，各處理低氮高效型品種京農(nóng)科728的產(chǎn)量在8 158.22～9 725.32 kg·hm-2之間，高氮高效型品種先玉335的產(chǎn)量在9 862.14～11 053.22 kg·hm-2之間。京農(nóng)科728在N2、N3的產(chǎn)量高于其他施氮處理；先玉335在N4、NCK的產(chǎn)量高于其他施氮處理。2019年，各處理京農(nóng)科728的產(chǎn)量在9 537.99～11 180.04 kg·hm-2之間，先玉335的產(chǎn)量在9 598.81～12 309.14 kg·hm-2之間。京農(nóng)科728的產(chǎn)量在N2達(dá)到最大值，顯著高于N4，但與其他施氮處理間差異未達(dá)到顯著水平；先玉335的產(chǎn)量在N4達(dá)到最大值，較NCK顯著提高28.23%，與N2差異未達(dá)到顯著水平。綜上年際間兩品種的產(chǎn)量隨施氮量變化差異較大。

表3 施肥量對玉米產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of nitrogen application on corn yield /(kg·hm-2)

注：不同小寫字母表示同一處理不同生育期之間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at different growth stage of the same treatment.圖7 施肥量對氮代謝關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of nitrogen application on relative expression of key enzyme genes in nitrogen metabolism

3 討論

氮素是植物細(xì)胞的重要組成部分，也是種子成熟和干物質(zhì)積累的重要限制因子。大量研究表明，植物體內(nèi)氮素積累量隨施氮量的增加呈單峰曲線變化，并最終影響干物質(zhì)的形成[25-26]。本研究表明，高氮高效型品種先玉335在N3、N4水平下，各生育時(shí)期植株的氮素積累高，平均產(chǎn)量達(dá)到最大值。N3水平下，玉米成熟期的葉鞘和雄穗中氮素積累量達(dá)到最大值；N4水平下，玉米成熟期的莖稈、葉片和籽粒氮素積累量均達(dá)到最大值，繼續(xù)增加施氮量至NCK水平，植株各器官的氮素積累量下降，產(chǎn)量也隨之降低。低氮高效型品種京農(nóng)科728在N2、N3水平下，平均產(chǎn)量達(dá)到最大值，各生育期植株的氮素積累量較高。相較于NCK，N2顯著增加了玉米成熟期莖稈、葉鞘、雄穗和籽粒的氮素積累量；N3顯著增加了玉米成熟期葉片、苞葉和穗軸的氮素積累量。說明，在減氮條件下，京農(nóng)科728表現(xiàn)出了更好的低氮適應(yīng)能力。有研究表明，施氮量顯著影響玉米產(chǎn)量，產(chǎn)量隨著施氮量的增加呈先升高后降低的趨勢[27-28]。在N1、N2水平下，京農(nóng)科728的莖稈表現(xiàn)出了較高的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)效率；而先玉335在N4、NCK水平下葉片和莖稈的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)效率較高。說明，高氮高效型和低氮高效型品種在氮素的需求上存在明顯差異，高氮高效型品種在整個(gè)生育期氮肥供應(yīng)不足將限制其生產(chǎn)潛力。本研究結(jié)果表明不同氮高效品種對氮素的需求、吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)能力是最終產(chǎn)量形成的重要因素。

植物的氮素吸收受氮代謝途徑的調(diào)控。在NR的催化作用下，根系將吸收的NO3-轉(zhuǎn)化為NO2-[29]。本研究表明，兩品種的NR活性均在大喇叭口期達(dá)到最大值，并且低氮型品種京農(nóng)科728的NR活性在N2水平最高，高氮型品種先玉335在N4水平最高。說明不同氮利用型玉米品種的氮素代謝酶活性與施氮量存在密切關(guān)系。在NiR的催化下，NO2-轉(zhuǎn)化為NH4+，NH4+在GS和GOGAT的催化下最終合成氨基酸[30]。本研究表明，京農(nóng)科728的NiR、GS和GOGAT均在低施氮水平下表現(xiàn)出較高的酶活性。京農(nóng)科728的GS和AS活性在拔節(jié)期達(dá)到最大值，并在生育后期能夠保持較高水平，說明氮肥的高效利用時(shí)期與酶活性時(shí)期保持一致。在生育后期，尤其是灌漿至成熟期，先玉335在高施氮量下才能保持高的NiR、GS和GOGAT活性。說明先玉335在生育后期需要大量的氮素供應(yīng)來完成籽粒形成與灌漿過程。Subedi等[31]也研究表明，從吐絲至成熟期的吸氮量占玉米整個(gè)生育期的60%以上。綜上可知，對高氮高效型品種先玉335后期氮肥的管控是其增產(chǎn)的關(guān)鍵。

外源氮肥的施用使植株體內(nèi)多個(gè)代謝途徑中的多個(gè)相關(guān)基因發(fā)生響應(yīng)，且不同基因型的玉米品種對施氮水平的響應(yīng)亦存在差異[29,32-33]。本研究表明，相較于拔節(jié)期，在大喇叭口期，京農(nóng)科782和先玉335的NR基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)，同時(shí)期NR活性顯著升高，大大提升了從拔節(jié)至大喇叭口期植株對氮素的吸收同化能力，這與李文龍等[29]的研究結(jié)果相似。大量研究已經(jīng)證實(shí)提高NR基因的表達(dá)能夠顯著提高NR活性，進(jìn)而提升作物對氮素的吸收同化效率[33-34]。本研究表明不同氮高效品種在不同施氮量下NR基因的表達(dá)量和酶活性存在差異。NR作為一種底物誘導(dǎo)酶存在一定的閾值，當(dāng)硝酸鹽濃度升高到一定水平之后，NR就不會再被誘導(dǎo)[35]。推測氮高效品種對氮素的吸收調(diào)控能力存在差異可能與誘導(dǎo)NR的閾值不同有關(guān)。

GS是氮代謝的核心酶之一。He等[36]研究表明，GS1-3和GS1-4在玉米葉片中高度積累，是玉米葉片GS1基因最主要的2個(gè)亞型，對氮的供應(yīng)和分配起著樞紐作用。本研究表明，相較于拔節(jié)期，在抽雄吐絲期和灌漿期，京農(nóng)科728的GS1-3基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)；在灌漿期，先玉335的GS1-3基因顯著上調(diào)；相較于拔節(jié)期，兩品種在其他生育期的GS1-4基因均顯著下調(diào)。兩品種不同生育時(shí)期GS1-3基因相對表達(dá)量上調(diào)說明相較于GS1-4，GS1-3可能在增加葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮著更加積極的作用。本試驗(yàn)也觀察到相較于拔節(jié)期，GS1-3在灌漿期葉片的基因表達(dá)顯著上調(diào)，且在玉米生育后期顯著上調(diào)，有效的維持了玉米生育后期GS的活性水平，從而使玉米在生育后期也能維持較高的氮素吸收和利用能力。

AS與GS在運(yùn)輸含氮分子方面具有聯(lián)合作用，在氮素遷移階段，AS會在ATP依賴性反應(yīng)中催化谷氨酰胺和天冬氨酸合成天冬酰胺[37-39]。玉米AS基因的環(huán)境調(diào)控機(jī)制尚鮮見報(bào)道。本研究表明，相較于拔節(jié)期，京農(nóng)科728灌漿期的AS1和AS3基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)。相較于其他各生育時(shí)期先玉335在拔節(jié)期的AS1基因顯著上調(diào)。說明參與氮代謝的ASs基因擔(dān)負(fù)著特殊功能，不同基因型品種的ASs基因?qū)ν庠吹氐捻憫?yīng)存在顯著差異。Wan 等[40]研究表明大豆葉片的AS1基因表達(dá)量與AS活性及大豆種子中蛋白質(zhì)含量呈顯著相關(guān)性。Li等[41]研究表明，在干旱脅迫下，AS與GS共同在葉片氮素轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要的作用。不同氮高效品種的AS基因表達(dá)結(jié)果證明了AS活性的響應(yīng)機(jī)制在兩品種間存在差異。在不同時(shí)期調(diào)控AS活性可以提高玉米葉片的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)效率。

4 結(jié)論

不同基因型品種對氮素的吸收利用存在差異。高氮高效型品種先玉335在施氮量為240～300 kg·hm-2時(shí)，平均產(chǎn)量達(dá)到最大值，其各生育時(shí)期氮素積累量也較高；低氮高效型品種京農(nóng)科728在施氮量為180～240 kg·hm-2時(shí)，平均產(chǎn)量達(dá)到最大值，其各生育時(shí)期氮素積累量也較高。氮代謝關(guān)鍵酶相關(guān)基因?qū)Σ煌咝推贩N的氮素吸收調(diào)控存在顯著差異。相較于高氮高效型品種先玉335，低氮高效型品種京農(nóng)科728對氮更為敏感。本研究為冀東地區(qū)不同品種的合理氮肥管控提供了理論依據(jù)。