反復呼吸道感染患兒外周血單個細胞中微小RNA-146a和微小RNA-155表達水平及其臨床意義

杜 贏 牛煥紅 馬 科

(1 西安工會醫(yī)院兒科，陜西省西安市 710100，電子郵箱：duying5405@sina.com；2 空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院兒科，陜西省西安市 710032；3 延安大學附屬醫(yī)院兒科，陜西省延安市 716000)

反復呼吸道感染(recurrent respiratory tract infection，RRTI)是兒科常見的多發(fā)病，兒童RRTI的發(fā)病率在20%左右[1]，其可嚴重影響患兒身體發(fā)育和健康狀況。RRTI病程長、易反復、易發(fā)生變態(tài)反應，且不易治愈，嚴重時可危及患兒心、肺、腦等重要器官。RRTI發(fā)病原因復雜，發(fā)病機制尚未完全清楚，營養(yǎng)不良、環(huán)境中病原微生物等因素均可能導致兒童發(fā)生RRTI[2]，而兒童機體免疫力下降、先天或后天免疫機制缺陷是RRTI發(fā)生的主要原因。微小RNA(micro RNA,miR)與機體免疫功能異常存在密切關(guān)系[3]。miR-146a、miR-155是目前頗受關(guān)注的兩種miR亞型。其中miR-146a位于第5q34染色體上，已被證實參與多種免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展，如強直性脊柱炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等[4]。miR-155在多種免疫細胞如T細胞、B細胞中被檢測到有表達，被認為與多種炎癥相關(guān)的因子和信號蛋白調(diào)控有關(guān)[5]。有研究結(jié)果顯示，miR-146a、miR-155均與免疫反應和炎癥過程密切相關(guān)，可參與部分免疫細胞的形成過程，在某些免疫性疾病中表達水平異常升高[6]。目前，關(guān)于miR-146a、miR-155的研究多圍繞類風濕性關(guān)節(jié)炎等典型免疫性疾病開展，鮮有針對RRTI的研究。因此，本研究通過檢測RRTI患兒外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miR-146a、miR-155的表達水平，探討RRTI與RRTI患兒機體炎癥反應和免疫狀態(tài)的關(guān)系，并評估m(xù)iR-146a、miR-155對小兒RRTI的診斷價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年5月至2019年5月在西安工會醫(yī)院兒科確診為RRTI的100例患兒作為研究組，其中男性53例、女性47例，年齡2個月至13歲[(8.69±2.46)歲]，2個月≤年齡≤2歲20例，2歲<年齡≤5歲42例，5歲<年齡≤13歲38例。納入標準：(1)符合《反復呼吸道感染的臨床概念和處理原則》[7]中關(guān)于RRTI的判定標準。(2)年齡0～14周歲；(3)患兒兩次感染間隔不少于8 d。排除標準：(1)合并先天性心臟病、先天性氣道發(fā)育異常等患兒；(2)1個月之內(nèi)服用過免疫調(diào)節(jié)劑、腎上腺激素者；(3)嚴重肝、腎、心、肺功能不全者；(4)不配合本研究者。選取同期在本院進行體檢的100例健康兒童為對照組，其中男性51例、女性49例，年齡2個月至13歲[(8.58±2.72)歲]，2個月≤年齡≤2歲18例，2<年齡≤5歲45例，5歲<年齡≤13歲37例。研究組與對照組兒童的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑與儀器 TRI Reagent?BD RNA提取試劑盒購自美國Molecular Research Center公司(貨號：TB126)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司(貨號K1622)；AceQ qPCR SYBR?Green Master Mix定量PCR反應試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(貨號：Q221-01)；引物由上海生工生物公司設計合成；C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、IgG、IgA酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(貨號：ml057570、ml025149、ml025158)；IgM ELISA試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司(貨號：BMS2098)；CFX96型實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；ELX800型全自動酶標儀購自美國Bio-Tek公司；BC-5800型五分類血球分析儀購自中國邁瑞公司；日立7600全自動生化分析儀購自株式會社日立制作所。

1.3 樣本采集 研究組患兒確診次日采集空腹外周靜脈血6 mL，對照組兒童于體檢時采集空腹外周靜脈血6 mL。立即取其中3 mL加入無菌肝素抗凝管(20 IU/mL)，下層血細胞用于提取PBMC，使用密度梯度離心法分離PBMC；余下3 mL在4℃條件下靜置促凝，30 min后，3 000 r/min離心10 min，取血清，置于-80℃低溫冷凍備用。

1.4 熒光定量PCR檢測miR-146a、miR-155表達水平 根據(jù)試劑盒說明書，提取PBMC中的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR儀對miR-146a、miR-155進行擴增。PCR反應體系共10 μL：miScript SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應條件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；45個循環(huán)。miR-146a、miR-155及內(nèi)參U6的引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法對血清miR-146a、miR-155表達水平進行定量分析。

表1 引物序列

1.5 感染指標、免疫指標檢測 采用BC-5800型五分類血球分析儀檢測白細胞計數(shù)；全自動生化分析儀測定患兒血清CRP、IgG、IgA、IgM水平，檢測操作嚴格按照試劑盒說明書進行。為控制檢測質(zhì)量，本次研究所有樣品的檢測均由檢驗科同一批人員在同一臺儀器上操作，每個樣本均設3個復孔。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩樣本t檢驗或t′檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗；采用Logistic回歸模型分析RRTI發(fā)病的影響因素；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析相關(guān)指標的診斷效能，應用正態(tài)z檢驗(MedCalc軟件)對曲線下面積(area under the curve，AUC)進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組PBMC中miR-146a和miR-155表達水平的比較 研究組PBMC中miR-146a、miR-155的相對表達水平低于對照組(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組PBMC中miR-146a和miR-155相對表達水平的比較(x±s)

2.2 兩組血清感染指標和體液免疫指標水平的比較 與對照組比較，研究組CRP水平、白細胞計數(shù)較高，而IgA、IgM、IgG水平較低(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組血清感染指標和體液免疫指標水平的比較(x±s)

2.3 RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對表達水平與感染和免疫指標的相關(guān)性 RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對表達水平與白細胞計數(shù)均呈負相關(guān)，而與IgA、IgM、IgG水平均呈正相關(guān)，且miR-146a與miR-155相對表達水平呈正相關(guān)(均P<0.05)，見表4。

表4 RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對表達水平與感染和免疫指標的相關(guān)性

2.4 影響RRTI發(fā)生的危險因素 以血清IgA、IgM、IgG水平和PBMC中miR-146a、miR-155相對表達水平為自變量，以是否發(fā)生RRTI為因變量，進行多因素Logistic回歸分析，變量賦值見表5，賦值時所取的分界值均為研究組各變量的平均值。結(jié)果顯示，miR-146a、miR-155相對表達水平降低，以及IgA、IgM、IgG水平降低均是影響RRTI發(fā)生的危險因素(均P<0.05)，見表6。

表5 變量賦值情況

表6 影響RRTI發(fā)生的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 PBMC中miR-146a、miR-155相對表達水平對RRTI的診斷效能 PBMC中miR-146a相對表達水平診斷RRTI的AUC為0.826(95%CI：0.795～0.858；P<0.001)，截斷值為1.675，靈敏度為80.60%，特異度為80.80%；PBMC中miR-155相對表達水平診斷RRTI的AUC為0.859(95%CI：0.829～0.889；P<0.001)，截斷值為1.904，靈敏度為87.10%，特異度為85.00%；兩者聯(lián)合診斷RRTI的AUC為0.905(95%CI：0.880～0.930；P<0.001)，靈敏度為84.90%，特異度為91.20%。兩者聯(lián)合診斷RRTI的AUC均大于miR-146a、miR-155單獨診斷(z=3.724，P<0.001；z=2.502，P=0.012)。見圖1。

圖1 miR-146a、miR-155相對表達水平以及二者聯(lián)合診斷RRTI的ROC曲線

3 討 論

RRTI是兒科臨床常見病，與小兒機體免疫功能低下及免疫功能紊亂有密切關(guān)系。RRTI患兒在一定程度上會出現(xiàn)細胞免疫和體液免疫功能降低[8-9]。miR是一類含多個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，其通過抑制靶基因的表達參與疾病的病理過程，在機體免疫中有著舉足輕重的作用[10]。例如，周玉蘭等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓模型損傷大鼠血清中，miR-146可抑制白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8等炎癥因子水平，從而顯著減輕炎癥反應[11]；哮喘患兒血清miR-155水平較對照組顯著降低，且miR-155水平與血清炎癥因子水平有關(guān)[12]。本研究中，RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對表達水平低于健康兒童，且兩者的相對表達水平呈正相關(guān)(P<0.05)；Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-146a、miR-155相對表達水平降低均是RRTI發(fā)生的危險因素(均P<0.05)。這提示miR-146、miR-155異常表達與RRTI發(fā)生有關(guān)，兩者可能共同參與調(diào)控RRTI的發(fā)病。

免疫球蛋白在體液免疫中有著舉足輕重的地位，其特異性地與抗原結(jié)合并激活補體，進而對吞噬細胞介導的細胞毒作用加以調(diào)理，進一步發(fā)揮抗菌、抗病毒作用。王琦等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，RRTI患兒血清IgG、IgA水平顯著降低，炎癥細胞因子IL-6水平顯著升高。進一步證實體液免疫與細胞免疫紊亂參與RRTI病情的發(fā)生和發(fā)展。此外，研究表明CRP、白細胞計數(shù)等感染指標可以反映呼吸道感染疾病的病情嚴重程度和轉(zhuǎn)歸情況[14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，研究組CRP水平、白細胞計數(shù)較高，免疫球蛋白IgA、IgM、IgG水平較低(P<0.05)，與上述文獻報告的結(jié)果相似；同時，RRTI患兒PBMC中miR-146a、miR-155相對表達水平與白細胞計數(shù)均呈負相關(guān)，與血清IgA、IgM、IgG呈正相關(guān)(均P<0.05)。由此推測miR-146a、miR-155表達水平的降低，可能促使細胞炎癥因子如IL-6的表達增加而使機體炎癥損傷嚴重，進一步促使細胞免疫功能降低和體液免疫功能紊亂，導致RRTI的發(fā)生。

我們進一步行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，RRTI患者PBMC中的miR-146a、miR-155的相對表達水平對RRTI具有一定的診斷效能，兩者聯(lián)合診斷RRTI的曲線下面積達0.905，高于單一指標單獨診斷，且靈敏度為84.90%，特異度為91.20%。這提示外周血PBMC中的miR-146a、miR-155水平均可用于RRTI的診斷，以篩查疑似RRTI患兒，而兩者聯(lián)合檢測時可進一步提高診斷效能。

綜上所述，RRTI患兒外周血PBMC中miR-146a、miR-155的表達水平顯著降低，兩者可能共同參與免疫炎癥調(diào)控過程，進而導致RRTI的發(fā)生，兩者聯(lián)合檢測對小兒RRTI診斷有一定臨床價值。本研究不足之處在于取樣均來自同一醫(yī)院，樣品來源具有單一性，且樣本量較少，因此計劃下一步擴大樣本來源和范圍進行深入研究。