乙醇提取-丙酮沉淀法提取分離茶皂素的工藝研究

張耀洲, 谷清義, 陳 瓊

(信陽農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,河南 信陽 464000)

茶皂素又名茶皂苷，是山茶科植物中含有的一類糖苷類物質(zhì)，是由糖體、皂苷元(配基)和有機(jī)酸三部分形成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的五環(huán)三萜混合物[1]。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，茶皂素不僅具有天然優(yōu)良的表面活性作用，還具有特殊的生物活性如溶血、魚毒、抗?jié)B、消炎、抗菌、殺蟲、滅螺、抗高血壓和保護(hù)腸胃的作用等[2]。此外，茶皂素在自然界中能自動(dòng)降解，對(duì)環(huán)境友好，對(duì)人體安全[3-4]。因此茶皂素在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的用途，市場需求量大。茶皂素的提取方法常見有3種，即水提法[5]、醇提法[6]以及在前2種方法基礎(chǔ)上的改進(jìn)提取法，如微波輔助提取法[7]、超聲波輔助提取法[8]等。其中醇提法以其提取速度快、后處理方便、產(chǎn)品純度較高等優(yōu)點(diǎn)而成為茶皂素提取的常規(guī)方法，常用溶劑為甲醇水溶液[9]、乙醇水溶液[10]、正丙醇[11]、正丁醇[12]等。由于溶劑毒性、環(huán)保及成本等原因，目前提取工藝多采用體積分?jǐn)?shù)為50%～85%乙醇作為提取溶劑。但乙醇提取所得茶皂素純度不夠高，還需要進(jìn)一步的純化才能得到高品質(zhì)的茶皂素。丙酮沉淀法由于沉淀速度快、操作簡便，適宜工業(yè)化生產(chǎn)而受到廣泛關(guān)注[13]。現(xiàn)在市售的茶皂素一般色澤較深、有特殊的氣味、純度較低，限制了茶皂素的進(jìn)一步開發(fā)利用。我國是茶皂素主產(chǎn)區(qū)，油茶籽提取茶油后剩余的殘?jiān)糠旨从筒栾炂芍泻柙硭氐牧窟_(dá)12%～18%[14]。目前國家正在大力扶持和發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，我國油茶種植總規(guī)模已達(dá)446.67萬公頃[15]。因此若能探索出一條新型、快速、高效、環(huán)保的高純度茶皂素提取純化工藝并運(yùn)用到工業(yè)化生產(chǎn)過程中，對(duì)于提高我國茶皂素生產(chǎn)水平、提高茶皂素在國際上的競爭力具有非常重要的意義，并且對(duì)于發(fā)展山區(qū)經(jīng)濟(jì)，延伸油茶產(chǎn)業(yè)鏈具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。楊鶴群等[16]對(duì)無患子皂素的乙醇提取-丙酮沉淀方法進(jìn)行了探討，研究發(fā)現(xiàn)該方法得到的無患子皂素品質(zhì)較高，純度達(dá)到90.5%，疏松潔白，顆粒較細(xì)。本研究以來源豐富的油茶餅粕為原料，以茶皂素的得率和純度為雙指標(biāo)，對(duì)適宜工業(yè)化生產(chǎn)的乙醇提取-丙酮沉淀方法進(jìn)行深入研究，以期為高純度茶皂素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

油茶餅粕，光山縣誠信實(shí)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司，經(jīng)檢測(cè)，主要成分為：粗脂肪8.83%(索氏抽提法，參照GB/T 10359—2008)、粗纖維14.11%(減重法，參照SN 14023—1990)、茶皂素13.75%(香草醛-濃硫酸比色法)、茶多糖28.36%(苯酚-硫酸法)、粗蛋白12.78%(凱氏定氮法，參照SN 14019—1990)。茶皂素對(duì)照品(純度98%)，上海九鼎化學(xué)科技有限公司。香草醛、石油醚(沸程60～90 ℃)、濃硫酸、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯均為分析純。

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AB135-S電子天平；101AS-2電熱恒溫干燥箱；HH- 4數(shù)顯恒溫水浴鍋；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHB-III循環(huán)水式真空泵。

1.2 茶皂素的提取工藝

1.2.1油茶餅粕的預(yù)處理 取一定量的油茶餅粕，粉碎過篩，取粒徑≤0.38 mm部分，105 ℃鼓風(fēng)干燥5 h。以石油醚(沸程60～90 ℃)為溶劑，90 ℃水浴索氏提取6～8 h至提取液無色。將脫脂后的油茶餅粕自然風(fēng)干，然后60 ℃鼓風(fēng)干燥1 h，備用。

1.2.2茶皂素的提取 稱取一定量預(yù)處理過的油茶餅粕，加入一定量不同體積分?jǐn)?shù)(50%～99.8%)的乙醇溶液，液料比(5 ∶1～20 ∶1，mL ∶g，下同)，在一定的溫度(30～80 ℃)下浸提一定時(shí)間(2～8 h)，趁熱過濾，濾液濃縮至干，105 ℃鼓風(fēng)干燥至質(zhì)量恒定得黃色固體粗茶皂素，備用。

1.3 茶皂素的純化工藝

預(yù)處理過的油茶餅粕100.0 g，提取溶劑為95%乙醇，液料比為9 ∶1，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為4 h，提取次數(shù)為2次，所得提取液記錄總體積后用于純化研究。

1.3.1提取液濃縮程度考察 取3份100 mL提取液，分別濃縮至小體積但未有固體析出(15 mL)、剛好有固體析出(約8 mL)、稠膏(含水量22%)，加入25 mL丙酮，磁力攪拌1 h，過濾，濾餅經(jīng)10 mL丙酮洗滌，105 ℃鼓風(fēng)干燥至質(zhì)量恒定后，測(cè)茶皂素純度和得率。

1.3.2丙酮用量考察 取5份100 mL提取液濃縮，在剛好有固體析出的濃縮液(約8 mL)中分別加入8、16、24、32、40 mL丙酮，磁力攪拌1 h，過濾，濾餅經(jīng)10 mL丙酮洗滌，105 ℃鼓風(fēng)干燥至質(zhì)量恒定后，測(cè)茶皂素純度和得率。

1.4 打漿純化

按優(yōu)選的提取及純化工藝條件制得的粗茶皂素用不同溶劑在液料比20 ∶1、40 ℃下快速攪拌4 h，趁熱過濾，105 ℃鼓風(fēng)干燥至質(zhì)量恒定得精制茶皂素，測(cè)定茶皂素純度和回收率。

1.5 茶皂素含量的測(cè)定及純度、得率計(jì)算

1.5.1茶皂素含量測(cè)定 采用香草醛-濃硫酸比色法[17]測(cè)定茶皂素的含量。精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的純度98%茶皂素對(duì)照品25.51 mg，置于25 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得茶皂素質(zhì)量濃度為1 g/L對(duì)照品溶液。精密稱取香草醛0.8 g，置10 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得80 g/L香草醛溶液。精密量取茶皂素對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于10 mL具塞刻度試管中，加水定容至1.0 mL。準(zhǔn)確加入80 g/L香草醛溶液0.5 mL，搖勻，于冰水浴中加入體積分?jǐn)?shù)77%的硫酸溶液4 mL，搖勻后于60 ℃水浴加熱15 min，然后置于冰水浴中冷卻10 min，取出恢復(fù)至室溫后于453 nm處以空白溶液為參比測(cè)定其吸光度(A)。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，茶皂素質(zhì)量濃度(C,g/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，其回歸方程為A=0.507 1C-0.002 1(R2=0.998 7)。精密稱取一定量的粗茶皂素，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶解并定容至25 mL。取經(jīng)稀釋至適當(dāng)濃度的樣品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按上述方法測(cè)定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算所測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度，即茶皂素的含量。

1.5.2茶皂素的純度和得率計(jì)算 根據(jù)式(1)和式(2)計(jì)算樣品純度和得率。

(1)

(2)

式中：X—茶皂素純度，%；C—茶皂素質(zhì)量濃度，g/L;V—樣品溶液的體積， mL；N—樣品溶液的稀釋倍數(shù)；m1—測(cè)定所取樣品的質(zhì)量，mg；Y—茶皂素得率，%；m2—提取所得粗茶皂素質(zhì)量，mg；m3—預(yù)處理過的油茶餅粕質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對(duì)茶皂素純度及得率的影響

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù) 在預(yù)處理過的油茶餅粕5.0 g、液料比8 ∶1、水浴85 ℃加熱回流提取3 h、提取次數(shù)1次條件下，考察不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取溶劑對(duì)茶皂素純度和得率的影響，結(jié)果見圖1(a)所示。

由圖1(a)可以看出，茶皂素的得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%以后，得率反而降低。而所得粗茶皂素的純度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，特別是用高體積分?jǐn)?shù)(95%以上)的乙醇提取后茶皂素的純度迅速增加，其原因可能為油茶餅粕中富含水溶性的茶蛋白、茶多糖在高體積分?jǐn)?shù)的乙醇中溶出減少。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，低體積分?jǐn)?shù)乙醇的提取液在減壓抽濾和旋轉(zhuǎn)濃縮后期會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，不便于操作，原因可能為低體積分?jǐn)?shù)的乙醇中含水量大，導(dǎo)致表面活性劑茶皂素溶解所致。盡管體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇作為提取劑時(shí)茶皂素得率要比高體積分?jǐn)?shù)的乙醇高，但其所得粗茶皂素純度要低很多，這樣勢(shì)必會(huì)增加后續(xù)純化的難度。因此，從獲得高品質(zhì)茶皂素難易程度看，高體積分?jǐn)?shù)乙醇作為提取劑更適合。而無水乙醇(體積分?jǐn)?shù)99.8%)提取雖然所得粗茶皂素純度更高，但考慮到茶皂素的得率較低以及無水乙醇的價(jià)格原因，本試驗(yàn)選取體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇作為提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)。若能對(duì)無水乙醇進(jìn)行很好地回收利用，控制在較低成本水平，如通過增加提取次數(shù)、時(shí)間等方式提高茶皂素得率，無水乙醇也有可能成為一種良好的提取溶劑，這有待下一步研究。

2.1.2液料比 在預(yù)處理過的油茶餅粕5.0 g、提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、水浴85 ℃加熱回流提取3 h、提取次數(shù)為1次條件下，考察不同液料比對(duì)茶皂素純度和得率的影響，結(jié)果見圖1(b)。由圖可以看出，茶皂素的得率隨著液料比的增加而增加，但純度變化不大。當(dāng)液料比在5 ∶1～9 ∶1之間時(shí)，茶皂素得率及雜質(zhì)溶出量增幅均明顯，達(dá)到9 ∶1以后，茶皂素的得率及雜質(zhì)溶出量增幅均趨于平緩。這說明隨著液料比的增加，傳質(zhì)推動(dòng)力加大，茶皂素溶出增多，當(dāng)液料比為9 ∶1時(shí)絕大部分茶皂素能被提取出來，再增加浸提溶劑的體積，茶皂素溶出有限，而且后續(xù)濃縮量增加?？紤]到成本及后處理工作量因素，選擇液料比9 ∶1較為合適。

2.1.3提取溫度 在預(yù)處理過的油茶餅粕5.0 g、提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、液料比為9 ∶1、提取時(shí)間為3 h、提取次數(shù)為1次的條件下，考察不同提取溫度對(duì)茶皂素純度和得率的影響，結(jié)果見圖1(c)。由圖可以看出，當(dāng)溫度在30～70 ℃之間，茶皂素的純度及得率隨著提取溫度的升高而迅速增加。當(dāng)溫度達(dá)到78 ℃(乙醇沸點(diǎn))時(shí)，茶皂素得率增加有限，而純度略有下降。原因可能為茶皂素的溶解度受溫度影響比較顯著，隨著溫度升高，茶皂素的溶解度增大；但溫度過高，在茶皂素助溶作用下多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)溶出也相應(yīng)增多，從而導(dǎo)致純度略有下降。另外趁熱抽濾操作時(shí)，沸騰狀態(tài)下乙醇揮發(fā)損失大，生產(chǎn)上也不便于操作。綜合考慮，選擇浸提溫度70 ℃較為合適。

2.1.4提取時(shí)間 在預(yù)處理過的油茶餅粕5.0 g、提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、液料比為9 ∶1、提取溫度為70 ℃、提取次數(shù)為1次的條件下，考察不同提取時(shí)間對(duì)茶皂素純度和得率的影響，結(jié)果見圖1(d)。由圖可以看出，當(dāng)浸提時(shí)間在2～4 h之間，茶皂素的純度及得率均隨著浸提時(shí)間的延長而顯著增加；當(dāng)浸提超過4 h時(shí)，茶皂素得率及純度增加有限。原因可能為隨著浸提時(shí)間的延長，浸提物濃度增加，傳質(zhì)動(dòng)力減弱，茶皂素及雜質(zhì)浸出速度減慢，最后達(dá)到平衡。說明浸提4 h已基本接近溶出平衡狀態(tài)，再延長浸提時(shí)間對(duì)提高茶皂素得率及純度作用不明顯，而且會(huì)增加能耗，降低生產(chǎn)效率。綜合考慮，選擇浸提時(shí)間4 h較為合適。

2.1.5提取次數(shù) 在預(yù)處理過的油茶餅粕10.0 g、提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、液料比為9 ∶1、提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為4 h、每次提取完后的油茶餅粕再按上述條件進(jìn)行提取，考察不同提取次數(shù)對(duì)茶皂素純度和得率的影響，結(jié)果見圖1(e)。由圖可以看出，4次提取的茶皂素在純度上沒有顯著差別，一次提取能把大部分茶皂素從油茶餅粕中提取出來，經(jīng)過3次提取后，油茶餅粕中殘余的茶皂素已很少?？紤]到生產(chǎn)成本及勞動(dòng)強(qiáng)度等因素，提取2次較為合適。

a.乙醇體積分?jǐn)?shù)ethanol volume fraction; b.液料比liquid to solid ratio; c.提取溫度extraction temperature;

2.2 茶皂素的純化工藝優(yōu)化

2.2.1提取液濃縮程度 提取液濃縮程度即丙酮加入時(shí)機(jī)對(duì)茶皂素純度、得率的影響結(jié)果如下：在濃縮至小體積但未有固體析出(15 mL)時(shí)加入丙酮，茶皂素純度最高(85.62%)，但得率較低(8.67%)；在稠膏(含水量22%)時(shí)加入丙酮，茶皂素得率最高(10.73%)，但純度最低(76.20%)；在剛好有固體析出(約8 mL)時(shí)加入丙酮，茶皂素純度、得率都較高(分別為84.88%、9.82%)。原因可能為稠膏中加入丙酮后形成一團(tuán)，不易分散，黃酮、多酚等雜質(zhì)未能充分溶解到丙酮中造成茶皂素純度相對(duì)降低，而濃縮液中未析出固體時(shí)加入丙酮，體系存在含水乙醇，使得部分茶皂素溶于丙酮中造成得率相對(duì)降低。另外，“剛好有固體析出”這一指標(biāo)，現(xiàn)象明顯，便于控制，所以選擇剛好有固體析出時(shí)加入丙酮。

圖2 丙酮用量對(duì)茶皂素純度及得率的影響Fig.2 Effects of acetone amount on the purity and yield of tea saponin

2.2.2丙酮用量 丙酮用量對(duì)茶皂素純度、得率的影響見圖2。

由圖2可以看出，隨著丙酮用量的增加，茶皂素的純度小幅度增加，得率先顯著增加后趨于穩(wěn)定。當(dāng)丙酮達(dá)到濃縮液體積3倍(24 mL)后，得率增幅趨于平緩，說明3倍濃縮液體積量的丙酮基本可使絕大部分茶皂素沉淀，原因可能為此條件下形成的溶劑極性正好適合茶皂素沉淀。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，丙酮用量為濃縮液體積4倍時(shí)，沉淀物固化最好，更容易分散，故選擇丙酮的加入量為濃縮液體積的4倍量。

2.2.3驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 按優(yōu)選的提取及純化工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，即預(yù)處理過的油茶餅粕5.0 g，在液料比為9 ∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%,70 ℃下提取2次，每次4 h，趁熱過濾，濾液合并，減壓濃縮至剛好有固體析出時(shí)，加入4倍濃縮液體積量的丙酮，收集沉淀即得粗產(chǎn)品。3次試驗(yàn)得率分別為9.82%、9.78%、9.85%(平均值9.82%)，相應(yīng)純度為85.28%、84.67%、85.56%(平均值85.17%)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.36%和0.53%。

2.3 不同溶劑打漿對(duì)粗產(chǎn)品純化效果的比較

丙酮沉淀法得到的粗產(chǎn)品純度仍不高，且顆粒較大不規(guī)則，顏色呈黃色，其品質(zhì)仍然有待提高。因此試驗(yàn)以純度為85.11%的粗茶皂素為對(duì)象，按1.4節(jié)操作，用不同溶劑打漿純化，結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑打漿對(duì)茶皂素純度及回收率的影響 Table 1 Effects of different solvent reslurrying on the purity and yield of tea saponin

由表1可以看出，乙酸乙酯基本沒有純化效果，但能使產(chǎn)品的成粉性得到明顯改善。無水乙醇雖能使產(chǎn)品純度提高，但回收率太低，而且產(chǎn)品易吸潮，顏色改變。粗產(chǎn)品在體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇中溶解，得不到產(chǎn)品。相比較而言，丙酮純化效果最好，但純度提高有限，打漿濾液在放置過程中有固體物質(zhì)析出，經(jīng)薄層色譜法(TLC法)和苯酚-硫酸法檢測(cè)，固體物質(zhì)主要為多糖?？傮w而言，幾種溶劑打漿純化效果均不理想，所以本試驗(yàn)未做進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

3.1采用乙醇提取-丙酮沉淀方法從油茶餅粕中提取茶皂素，以茶皂素的得率和純度為指標(biāo)，考察了提取條件對(duì)提取效果的影響，以及提取液濃縮程度、丙酮用量對(duì)純化效果的影響，確定的較佳工藝條件為：預(yù)處理過的油茶餅粕5.0 g，液料比為9 ∶1(mL ∶g)，體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇為提取溶劑，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間4 h，提取次數(shù)為2次，丙酮加入時(shí)機(jī)為濃縮至剛好有固體析出時(shí)，丙酮用量為4倍濃縮液體積量。按此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的茶皂素純度為85.17%，得率為9.82%。

3.2在乙醇提取-丙酮沉淀法提取純化茶皂素的基礎(chǔ)上，探討了不同溶劑打漿對(duì)產(chǎn)品純化效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：打漿純化所用溶劑丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇和體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇純化效果均不理想。其他單一溶劑或混合溶劑能否用于打漿純化，或能否選用適合工業(yè)化生產(chǎn)的大孔樹脂吸附純化有待進(jìn)一步研究。