雙溶劑微池頂空萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析竹葉花椒中揮發(fā)性成分

楊玉賢，高云濤，鄒維，丁崗芯，崔恩浩，熊華斌，石峰

1(云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明，650500)2(云南民族大學(xué)，生物基材料綠色制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明， 650500)

花椒屬于蕓香科灌木，是一種有較高食用和藥用價值的植物資源[1]。我國的花椒資源十分豐富，主要產(chǎn)于四川、重慶、陜西、甘肅、山東等省[2-3]。花椒作為“八大調(diào)味品”之一，不僅具有獨特的香麻味，還具有抗氧化、抗癌、降血脂、祛風(fēng)除濕、麻醉、殺蟲和抑菌等多種功效[4-8]。四川漢源主要有竹葉花椒(習(xí)稱青花椒)、紅花椒2種品種，在香氣感官等方面具有很大的差異。竹葉花椒主要在未成熟時采收，果皮顏色為綠色，氣香，味微甜而辛，比紅花椒的醇類物質(zhì)含量高2～3倍，主要是特征揮發(fā)性成分芳樟醇[9]。竹葉花椒含有豐富的生物堿、揮發(fā)油及酰胺類化合物等成分[10-11]，具有重要的科學(xué)研究意義和經(jīng)濟(jì)價值。

花椒中含有多種揮發(fā)性風(fēng)味成分，在揮發(fā)性成分研究中受到廣泛關(guān)注[12-14]。蒲鳳琳等[15]用水蒸氣蒸餾法提取，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析，從花椒中鑒定出37種揮發(fā)性風(fēng)味成分。頂空分析的研究日益受到關(guān)注，孟佳敏等[16]通過頂空固相微萃取，經(jīng)GC-MS分析從花椒中鑒定出42種揮發(fā)性風(fēng)味成分；張玉霖等[17]同樣采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS方法對市售花椒油揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析，共鑒定出47種揮發(fā)性風(fēng)味成分。固相微萃取操作方便、無需溶劑、靈敏度高，但其萃取頭成本較高，多次使用后可能出現(xiàn)萃取頭交叉污染等問題[18-19]。單滴微萃取因其成本低、溶劑用量少、操作簡便快速，應(yīng)用廣泛等優(yōu)點受到關(guān)注，但存在萃取液滴體積小，懸掛穩(wěn)定性差，易揮發(fā)，有機(jī)溶劑揮發(fā)損失過快的缺點，導(dǎo)致無法使用乙酸乙酯、正己烷等揮發(fā)性有機(jī)溶劑萃取[20-21]。

針對上述方法存在的問題，本文設(shè)計制作了一種新型微池頂空萃取裝置，在此基礎(chǔ)上建立一種以乙酸乙酯、正己烷為萃取劑的雙溶劑微池頂空溶劑萃取方法，以實現(xiàn)竹葉花椒揮發(fā)性風(fēng)味成分的溶劑頂空微萃取，并結(jié)合GC-MS對竹葉花椒揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，并與頂空固相微萃取進(jìn)行了對照。以探究乙酸乙酯和正己烷為萃取劑的雙溶劑微池頂空萃取方法的實際應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料

儀器：ISQ120839 THERMOFISHER(ISO)氣-質(zhì)聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技公司；CPA2014C348-32氣相色譜儀，島津企業(yè)管理有限公司；57328-U 50/30 μm (DVB/CAR/PDMS)固相微萃取SPME纖維頭，美國Supelco公司；微量進(jìn)樣器(50.0 μL、10.0 μL),上海安亭科學(xué)儀器廠；20 mL鉗口頂空瓶。

試劑：乙酸乙酯、正己烷,均為色譜純；無水氯化鈣,分析純。

竹葉花椒干品(產(chǎn)自四川漢源地區(qū))，購于成都川味水滸之香料王食品店。

1.2 微池頂空萃取裝置

本文采用的微池頂空萃取裝置如圖1所示，該裝置由鉗口頂空瓶和微萃取池組件兩部分組成，鉗口頂空瓶包括瓶體及瓶蓋兩部分，瓶蓋包括硅膠及四氟乙烯雙層墊片，微萃取池組件包括圓底脫水微池、尖底萃取微池、吸盤和掛柱，萃取微池、脫水微池、掛柱和吸盤均為聚乙烯醇材料，掛柱下端分別與萃取微池、脫水微池黏接，掛柱上端與吸盤黏接，吸盤與頂空瓶蓋下層四氟乙烯墊片吸合，墊片置于瓶蓋，并與瓶口密閉鉗合，將萃取微池、脫水微池探入頂空瓶上方。

a-微池頂空萃取裝置；b-微萃取組件；c-結(jié)構(gòu)和實物圖1 微池頂空萃取裝置圖Fig.1 Micro cell headspace extraction device

1.3 方法

1.3.1 雙溶劑微池頂空萃取操作

使用時，稱取1.0 g竹葉花椒樣品于頂空瓶中，在脫水微池中預(yù)置入無水氯化鈣等脫水劑，用微量進(jìn)樣針吸取適量萃取劑，針頭刺破頂空瓶墊將乙酸乙酯、正己烷2種萃取劑分別注入不同萃取微池中，在50 ℃條件下萃取30 min[6]，用進(jìn)樣針吸出萃取微池中的剩余萃取劑1.0 μL進(jìn)行后續(xù)的氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

1.3.2 頂空固相微萃取

采用固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)纖維頭和SPME纖維組件支架共同組裝而成的固相微萃取裝置，稱取竹葉花椒樣品1.0 g，50 ℃條件下萃取30 min，按照文獻(xiàn)[17]頂空測試微萃取方法進(jìn)行操作，進(jìn)行后續(xù)GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS分析

色譜條件：色譜柱：DB-WAX(30 m×0.25 m×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度260 ℃，檢測器溫度220 ℃；柱初溫50 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升到95 ℃持續(xù)1 min；以2 ℃/min升到110 ℃，保持1 min；以4 ℃/min升到170 ℃，保持1 min；再以15 ℃/min升到200 ℃，保持3 min保持；高純氦氣(純度>99.999%)；載氣流速0.8 mL/min；分流比8∶1；進(jìn)樣量1.0 μL，溶劑延遲時間3 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度260 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～500m/z。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味成分的分析

竹葉花椒樣品中各未知揮發(fā)性風(fēng)味成分的定性通過計算機(jī)檢索，利用儀器所配置的NIST 11譜庫檢索匹配，選取相似度(SI與RSI值均大于800時可予以選擇)，并結(jié)合保留時間及參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]所得。同時采用峰面積歸一化法確定竹葉花椒中不同揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量，如公式(1)所示：

(1)

式中：A1為單組分揮發(fā)性風(fēng)味成分的峰面積；A2為揮發(fā)性風(fēng)味成分總峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 微池頂空萃取裝置的設(shè)計及制備

本文提出一種以易揮發(fā)溶劑如乙酸乙酯和正己烷作為萃取劑的微池頂空萃取方法，首先制作了如圖1所示的微池頂空萃取裝置，通過尖底萃取微池中放置的揮發(fā)性溶劑對揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行萃取。同時在微池頂空萃取池下方設(shè)置一圓底脫水微池以去除混于揮發(fā)性風(fēng)味成分的水分。

微萃取池組件中的掛柱和吸盤材料均為聚乙烯醇，材料易得，以方便黏合。微池頂空萃取組件通過吸盤式結(jié)構(gòu)，以便于與光滑的聚四氟乙烯墊片吸合。微池頂空萃取池設(shè)計為尖底結(jié)構(gòu)，以方便進(jìn)樣針針頭取樣。采用如圖1所示結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢在于不僅不改變已有頂空瓶的基本結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)精小但方便制作，且已有的頂空瓶及進(jìn)樣系統(tǒng)，可以將近200.0 μL易揮發(fā)的萃取劑置于其中，避免了萃取劑懸掛穩(wěn)定性差和有機(jī)萃取劑揮發(fā)損失過快等問題。

為了進(jìn)一步研究，易揮發(fā)的萃取劑在微池頂空萃取裝置中揮發(fā)穩(wěn)定性的問題，通過溶劑頂空萃取在50 ℃條件下萃取30 min后，乙酸乙酯和正己烷等萃取劑初始體積與剩余體積關(guān)系如圖2所示。

圖2 微池頂空萃取裝置中乙酸乙酯和正己烷的揮發(fā)穩(wěn)定性Fig.2 The stability problem of ethyl acetate and n-hexane in micro cell headspace extraction device

由圖2可知，用乙酸乙酯和正己烷萃取劑萃取竹葉花椒中的揮發(fā)性成分時，乙酸乙酯的初始體積在35.0～60.0 μL時，近乎呈線性變化；正己烷的初始體積在50.0～70.0 μL時，正己烷萃取劑的剩余體積隨初始體積的增加而增多。在30 min頂空萃取平衡時間內(nèi)，萃取劑剩余量仍然保留有近10.0 μL，滿足后續(xù)萃取物GC-MS分析，故選用乙酸乙酯、正己烷等萃取劑的初始體積分別為40.0、60.0 μL 進(jìn)行后續(xù)實驗分析。

2.2 竹葉花椒揮發(fā)性成分雙溶劑微池頂空萃取

本文采用微池頂空萃取裝置(圖1)，結(jié)合GC-MS分析，研究了乙酸乙酯和正己烷2種萃取劑對竹葉花椒揮發(fā)性風(fēng)味成分的萃取行為，并與頂空固相微萃取進(jìn)行對照，圖3-a、3-b和3-c分別是正己烷、乙酸乙酯和頂空固相微萃取物的GC-MS總離子流圖。通過計算機(jī)檢索，并用NIST 11譜庫檢索相互匹配進(jìn)行定性分析，將相似度(SI與RSI值均大于800)的組分先進(jìn)行選擇，再結(jié)合保留時間及參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]對GC-MS檢測結(jié)果進(jìn)行鑒定，確定相應(yīng)化合物的名稱。各組分相對含量按峰面積歸一化法計算公式[公式(1)]計算。將竹葉花椒中各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的數(shù)量和相對含量進(jìn)行統(tǒng)計匯總，見表1。

a-正己烷；b-乙酸乙酯；c-頂空固相微萃取圖3 雙溶劑微池頂空萃取物GC-MS總離子流圖Fig.3 The GC-MS total ion flow diagram of double solvent micro cell headspace extract

表1 正己烷和乙酸乙酯萃取物中的揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 1 The main volatile flavor components in n-hexane and ethyl acetate extracts

續(xù)表1

由表1可以看出，從正已烷和乙酸乙酯萃取物中分別鑒定出27種、30種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中重合的有22種揮發(fā)性成分，不重合的有13種揮發(fā)性成分，共鑒定出35種，與頂空固相微萃取獲得的34種相接近，可實現(xiàn)基于正己烷和乙酸乙酯等揮發(fā)溶劑的頂空溶劑萃取，且說明雙溶劑微池頂空萃取中2種溶劑具有一定的萃取互補(bǔ)作用。

雙溶劑微池頂空萃取獲得竹葉花椒中的主要揮發(fā)性風(fēng)味成分(出現(xiàn)在兩相的成分，以含量高的為參考結(jié)果)芳樟醇的相對含量(43.38%)明顯優(yōu)于頂空固相微萃取(26.02%)。芳樟醇來源于天然產(chǎn)物，屬于鏈狀萜烯醇類，不僅有鈴蘭香氣，香氣柔和透發(fā)，還具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠及其他多種香味成分和藥理活性，芳樟醇及其衍生物在香化和日化工業(yè)上應(yīng)用廣泛[22-25]。

本文進(jìn)一步對正己烷、乙酸乙酯萃取物中各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的數(shù)量和相對含量進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用Origin 2018作圖軟件繪制雷達(dá)區(qū)域分布圖，各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的數(shù)量及相對含量統(tǒng)計結(jié)果見圖4。

a-數(shù)量；b-相對含量圖4 各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的數(shù)量和相對含量統(tǒng)計Fig.4 Quantity and relative content statistics for various volatile flavor components

由圖4可以看出，變化較大的烯烴類化合物(雙溶劑微池頂空萃取共鑒定出18種，相對含量為74.42%；優(yōu)于頂空固相微萃取鑒定出的15種，相對含量為42.47%)是竹葉花椒各類揮發(fā)性風(fēng)味成分中數(shù)量及相對含量最多的一類物質(zhì)，其次是醇類、酯類，而醛類、酮類、烷烴類、醚類和芳香烴則變化差異不大。從圖4-a各類揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量的整體統(tǒng)計雷達(dá)區(qū)域分布圖來看，雙溶劑微池頂空萃取可達(dá)到與頂空固相微萃取相接近的效果，對于烯烴和酯類物質(zhì)的萃取效果要比頂空固相微萃取的萃取效果更佳。而由圖4-b各類揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量整體統(tǒng)計雷達(dá)區(qū)域分布圖來看，雙溶劑微池頂空萃取得到的揮發(fā)性風(fēng)味成分相對含量所占總面積要大大優(yōu)于頂空固相微萃取的結(jié)果。

3 結(jié)論

本文針對乙酸乙酯、正己烷等揮發(fā)性萃取劑在萃取過程中不穩(wěn)定、易揮發(fā)損失的特點，在已有頂空瓶的基礎(chǔ)上設(shè)計了一種新型微池頂空萃取裝置，裝置不改變已有頂空瓶的基本結(jié)構(gòu)，小巧但易于制作，解決了溶劑頂空萃取穩(wěn)定性差的問題，實現(xiàn)了基于乙酸乙酯和正己烷等揮發(fā)溶劑的頂空萃取。在此基礎(chǔ)上，建立了以不同極性的易揮發(fā)性溶劑乙酸乙酯和正己烷為萃取劑的雙溶劑微池頂空萃取方法，利用GC-MS對竹葉花椒萃取物中揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了分析，操作簡單、快速，獲得揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量上與頂空固相微萃取相接近，相對含量總體上優(yōu)于頂空固相微萃取。本法靈敏度高，精密度好，相對于已有的頂空固相微萃取或單滴頂空微萃取法，分析成本大幅度降低，不僅明顯改進(jìn)了頂空過程中萃取劑的穩(wěn)定性問題，而且結(jié)果表明，雙溶劑微池頂空萃取中2種溶劑起到良好的互補(bǔ)萃取作用，簡單、快速、在獲得各類揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量以及相對含量上的整體萃取效果要優(yōu)于頂空固相微萃取法，為揮發(fā)性風(fēng)味成分的頂空分析提供了一種新的思路。