新型冠狀病毒SARS-CoV-2的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進展

陳新鵬，董昌金，李文靜，涂俊銘，夏 險

(1.食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，生物學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.湖北師范大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

0 引言

冠狀病毒(Coronavirus)是一種有包膜、核衣殼和單條正鏈RNA組成病毒[1, 2]。該病毒可感染哺乳動物或者鳥類的呼吸系統(tǒng)，從而引發(fā)疾病。最早發(fā)現(xiàn)的人類冠狀病毒是HCoV-229E(1966年)和HCoV-OC43(1967年)[1]?？茖W(xué)家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重呼吸道感染病毒SARS-CoV(2003年)、HCoV-NL63(2004年)、HcoV-HKU1(2005年)和中東呼吸道嚴(yán)重感染病毒 MERS-CoV(2012年)[2]。HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HcoV-HKU1四種冠狀病毒通常只會引起普通感冒癥狀[3]，而SARS-CoV和MERS-CoV則會導(dǎo)致嚴(yán)重呼吸道疾病甚至死亡[4]。冠狀病毒基因組包括5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，復(fù)制酶復(fù)合體(orf1ab)，刺突S 基因，小包膜E基因，包膜糖蛋白M基因，核衣殼N基因，3’非翻譯區(qū)(3’UTR)和幾個未知功能的開放閱讀框組成。

2019年12月初爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎，病原體為不同于SARS-CoV和MERS-CoV的嚴(yán)重性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。其在電子顯微鏡下的形態(tài)如圖1所示(http://www.nmdc.cn/nCoV)。自爆發(fā)以來，該病毒受到中國政府乃至世界各國和世界衛(wèi)生組織的高度重視。本文對SARS-CoV-2的發(fā)現(xiàn)、病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進展等方面進行了綜述。

圖1 SARS-CoV-2電鏡圖(新型冠狀病毒國家科技資源服務(wù)系統(tǒng))

1 病毒的發(fā)現(xiàn)

2019年12月初，武漢陸續(xù)出現(xiàn)與華南海鮮批發(fā)市場相關(guān)的肺炎患者，起初被認為與SARS相關(guān)，引起湖北省武漢市和國家疾病控制中心的注意；2020年1月1日，華南海鮮批發(fā)市場被關(guān)閉；2020年1月6日，國家疾病控制中心正式啟動二級響應(yīng)機制；2020年1月7日，中國疾病控制中心發(fā)布此次疫情的爆發(fā)由一種新型的冠狀病毒SARS-CoV-2引起，不同于MERS-CoV 和SARS-CoV；2020年1月10日，SARS-CoV-2 的全基因組公布；2020年1月12日，世界衛(wèi)生組織(WHO)正式將這種新型冠狀病毒命名為2019-nCoV；2020年1月13日，首次在境外(泰國)檢測到SARS-CoV-2的感染患者；2020年1月15日，國家疾病控制中心啟動一級響應(yīng)機制(最高級別)；2020年1月24日，有報道從患者組織樣品中分離和鑒定了SARS-CoV-2病毒顆粒，并對該病毒進行了表征[5]。2020年1月30日，WHO認定此次疫情為“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”。2020年2月11日國際病毒分類委員會冠狀病毒研究小組將2019-nCoV正式命名為嚴(yán)重性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。隨著病毒的擴散，疫情逐漸在全世界蔓延開來。

2 病毒的分類地位

冠狀病毒屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)，其得名來自于表面的病毒粒子像王冠(拉丁文即corona)[6]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，冠狀病毒主要分為α、β、γ和δ四個屬[7]，此前報道的人類冠狀病毒分布在α-冠狀病毒屬(HCoV-229E、HCoV-NL63)、β-冠狀病毒屬(HCoV-OC43、HcoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV)兩大類中[1]。SARS-CoV-2與β-冠狀病毒屬的復(fù)制酶保守結(jié)構(gòu)域相似度接近90%，而且系統(tǒng)進化分析和β-冠狀病毒屬特異性基因的擴增結(jié)果也表明SARS-CoV-2屬于β-冠狀病毒屬(圖2)[8，9]。

圖2 SARS-CoV-2的進化分析[9]

3 溯源與進化

全基因組公布后，研究者對SARS-CoV-2進行了溯源分析?；谌蚪M的進化序列分析表明，SARS-CoV-2與來自蝙蝠的SARS-CoV-like冠狀病毒位于同一分支[8]。利用Beta冠狀病毒基因組中的一個互補回文序列(Nankai complemented palindrome)和其所在的編碼區(qū)(Nankai CDS)進行的溯源分析表明SARS-CoV-2可能源自中華菊頭蝠[10]。但是，也有報道基于不同動物物種之間的相對同義密碼子使用偏愛(SCUB)情況進行分析，結(jié)果認為蛇可能是SARS-CoV-2病毒的來源[11]。另外，也有研究者通過比較所有宿主在脊椎動物上的病毒傳染模式，提出SARS-CoV-2可能源自水貂[12]。2020年2月7日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)布會稱從穿山甲中分離出的毒株的全基因組與SARS-CoV-2毒株相似度達90.3%[13].隨后，美國研究者基于冠狀病毒S蛋白上的與受體結(jié)合Motif的預(yù)測表明穿山甲攜帶的毒株與SARS-CoV-2具有高度的相似性[14]。關(guān)于SARS-CoV-2的來源，目前大多數(shù)研究者偏向源自于蝙蝠，中間宿主可能是穿山甲[15]，傳染途徑如圖3.近期，牛津大學(xué)的研究者表示SARS-CoV-2早在2019年爆發(fā)前就已潛伏于自然環(huán)境中。關(guān)于SARS-CoV-2的來源還有待科學(xué)界的進一步研究。

圖3 SARS-CoV-2的可能傳染路徑[15]

病毒的突變導(dǎo)致病毒的進化，目前已有國外內(nèi)多個科研團隊基于不同的角度分析了SARS-CoV-2的進化情況。早期我國研究者基于樣本的突變分析，將病毒分為L型和S型，L型由S型進化而來，更具有傳播性[16]。隨后英國劍橋大學(xué)和德國明斯特大學(xué)將我國研究者石正麗團隊發(fā)現(xiàn)的與SARS-CoV-2高度相似的蝙蝠冠狀病毒作為起源，分析了SARS-CoV-2的突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變可以分為A、B、C三中類型，其中A型與蝙蝠冠狀病毒關(guān)系更近，可能為原始祖先，這類主要分布在美國和澳大利亞；B型由A型演化而來，武漢地區(qū)的病例多為B型；C型由B型演化而來，多分布于歐洲地區(qū)[17]。目前，關(guān)于病毒進化的研究還在不斷繼續(xù)，有待進一步的大樣本分析和深入研究。

4 病毒的流行病學(xué)及致病性

截止2020年7月5日，我國累計確診85 320例，遍布全國338個城市，其中68 135例(84.99%)在湖北?。蝗珖塾嬛斡?0 161例，其中湖北治愈63 623例(79.36%)；累計死亡4 648例，其中湖北省4 512例(97.07%)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO官網(wǎng)數(shù)據(jù)，目前疫情已蔓延至全球192個國家和地區(qū)，累計確診11 500 492例，死亡532 716例[18]。根據(jù)中國內(nèi)地72 314例病例的流行病學(xué)特征分析，在確診病例中(44 672例)，大多數(shù)年齡在30～79歲(86.6%)、輕/中癥病例為主(80.9%)、粗病死率為2.3%[18，19].有研究者基于基因組分析，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2爆發(fā)可能于早于2019年12月[20]。流行病學(xué)研究表明，SARS-CoV-2的傳染性更強，具有致使全國甚至全球大流行的潛在風(fēng)險[21]。更令人憂心的是SARS-CoV-2潛伏期為1～14天，多為3～7天，而且初期癥狀不明顯，因此導(dǎo)致其隱蔽性更強，更容易傳播[22～24]。患者人群早期胸部影響學(xué)表現(xiàn)為局部病變，呈斑片狀、亞段或節(jié)段性磨玻璃影，伴或不伴小葉間隔增厚；進展期病灶增多、范圍擴大，累及多個肺葉[5，22]。重癥期雙肺彌漫性病變，少數(shù)呈“白肺”表現(xiàn)，實變影為主，合并磨玻璃影，多伴條索影，空氣支氣管征[5，22]，如圖4.而且，近期的研究表明SARS-CoV-2的攻擊位點除了呼吸道外，研究者還發(fā)現(xiàn)在心臟、食道、膽管、回腸、腎、膀胱、睪丸等器官中均能檢測到SARS-CoV-2受體ACE2的高表達，說明SARS-CoV-2也可能破壞這些器官[25～27]。

圖4 輕癥(A)和重癥(B)新冠肺炎病人的CT圖像[22]

5 病毒檢測技術(shù)研究進展

目前，SARS-CoV-2的診斷主要結(jié)合流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)(呼吸道癥狀、醫(yī)學(xué)影像學(xué)、血常規(guī))、病原學(xué)證據(jù)(核酸檢測)、免疫化學(xué)等方法來確定。由于其他病毒性和細菌性肺炎在臨床癥狀和醫(yī)學(xué)影像學(xué)上可能存在重疊，因此選擇不同的檢測方法對于確診來說尤其重要。

5.1 利用核酸檢測病毒

核酸檢測的方法有許多，各有優(yōu)缺點。基因組測序技術(shù)可鑒定未知病原體，準(zhǔn)確度高，但是不利于快速大量檢測；巢式反轉(zhuǎn)錄PCR作為熒光定量的補充，但是檢測效率和普及率低；生物芯片可以批量檢測樣品，但是費用高和設(shè)備要求高；逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增法可以實現(xiàn)現(xiàn)場篩查，但是結(jié)果易出現(xiàn)假陽性。逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR準(zhǔn)確率和靈敏度高，但成本高。目前，核酸檢測主要基于反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR，該方法靈敏度高、檢測速度快，在病毒檢測方面具有很大的優(yōu)勢，是目前檢測病毒最常用的手段之一。該方法的步驟如圖5：1)采集有臨床癥狀病人的上呼吸道咽拭子樣本；2)用核酸提取試劑盒提取樣本的核酸；3)反轉(zhuǎn)錄，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA；4)采用定量PCR儀進行PCR擴增；5)在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)檢測到擴增產(chǎn)物的信號則說明樣本中有新型冠狀病毒的RNA；如果在規(guī)定范圍內(nèi)沒有檢測到擴張增信號，則說明樣本中可能不含新型冠狀病毒的RNA或者含量很低(圖5)[28]。熒光定量RT-PCR涉及到核酸提取，引物特異性、溫度、循環(huán)數(shù)等很多因素影響，有一定的局限性。

圖5 核酸檢測示意圖[28]

5.2 免疫化學(xué)檢測及其他手段

免疫化學(xué)手段是主要利用抗原與抗體特異性反應(yīng)結(jié)合對抗原或者抗體定性定量的方法，該方法具有高度特異性和靈敏性。IgG為正常人體血清中最主要的抗體成分，是機體重要的抗菌和抗病毒抗體。IgM是初次體液免疫中最早出現(xiàn)的抗體，具有中和細菌和病毒的功能。當(dāng)新型冠狀病毒侵入機體后，血清中特異性抗體IgG和IgM含量增高。利用抗體與待檢測病毒抗原相互作用這一特性，因此可以判斷是否存在病毒感染[29]。檢測結(jié)果IgG、IgM都為陽性表明處于感染期；IgG為陽性，IgM為陰性時，說明可能處于感染的中晚期；IgG為陰性、IgM為陽性，表明可能是處于感染早期；IgG和IgM都為陰性時，說明是無感染或者處于感染的潛伏期。

常見的免疫化學(xué)檢測手段有膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光等方法。膠體金免疫層析法法無需復(fù)雜的儀器，操作簡單，可直接目視判定結(jié)果，檢測時間只需十幾分鐘，適合于現(xiàn)場快速篩查，但其準(zhǔn)確度和靈敏度有限，可以作為SARS-CoV-2核酸檢測的輔助方法?；瘜W(xué)發(fā)光法具有靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬的特點，但依賴于特定的化學(xué)發(fā)光儀，檢測成本較高。酶聯(lián)免疫吸附法靈敏度較高，載體標(biāo)準(zhǔn)化難度較低，但檢測速度慢、易污染、步驟較為繁瑣。在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)抗原抗體的特性設(shè)計不同的檢測法，目前有雙抗體夾心法、免疫抑制法、競爭法、直接法和間接法等類型。

6 展望

SARS-CoV-2自爆發(fā)以來，給人類健康造成重大威脅，引起大家重視。目前，許多科研工作者投入到該病毒的研究中去。各級政府及科研單位都相繼啟動應(yīng)急科研項目。雖然科研人員研發(fā)了檢測病毒毒株的方法，發(fā)現(xiàn)部分有效藥物和疫苗，但急需找到該病毒的源頭，切斷其傳染途徑。