迷迭香提取液的抑菌作用及穩(wěn)定性研究

孫長(zhǎng)花，丁娟芳，王君，李曉鳳

(1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué) 生物與化工工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

隨著人們食品安全意識(shí)的提高和化學(xué)防腐劑殘留問(wèn)題的凸顯，人們對(duì)天然防腐劑的需求不斷增加，因此安全高效的天然植物源防腐劑受到廣泛關(guān)注[1]，其中，天然食用香辛料具有抑菌、抗氧化作用[2,3]，其防腐保鮮研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)，屬唇形科迷迭香屬植物，是一種具有悠久栽培歷史和食用歷史的天然香料植物[4]。迷迭香中有效成分為迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸等，具有抑菌、抗氧化、消炎等功效[5-8]。迷迭香提取物已被列入歐盟有機(jī)食品添加劑名單[9]。目前，關(guān)于迷迭香中抑菌成分的研究主要集中于提取方法 以及在食品防腐保鮮和抗氧化方面的應(yīng)用[10-18]，而未見(jiàn)其抑菌穩(wěn)定性的研究報(bào)道。本文旨在對(duì)迷迭香提取液的抑菌作用、最小抑菌濃度及影響抑菌穩(wěn)定性的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為迷迭香開(kāi)發(fā)成安全高效的天然食品防腐劑和抗氧化劑并運(yùn)用于食品防腐保鮮提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

迷迭香：產(chǎn)地云南，購(gòu)自揚(yáng)州眾成堂大藥房；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌：均由揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、酵母粉、牛肉浸膏、瓊脂；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、丙酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鐵、硫酸亞鐵：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司；JA2003N電子天平 上海精密儀器有限公司；PHS-3G酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHG-9003電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HPX-80生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 迷迭香提取液的制備

采用超聲波輔助提取獲得迷迭香提取液。迷迭香干燥后粉碎，過(guò)80目篩。準(zhǔn)確稱取一定量的粉末，按照料液比1∶10加入80%乙醇溶液，置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中，恒溫50 ℃，浸提50 min。采用真空泵抽濾，收集濾液，真空低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，制得迷迭香提取液。

1.3.2 菌懸液的制備

將實(shí)驗(yàn)室提供的菌種進(jìn)行活化，用平板稀釋法測(cè)定菌落總數(shù)?；罨蟮募?xì)菌用無(wú)菌生理鹽水稀釋為含菌數(shù)5×108CFU/mL的菌懸液。

1.3.3 抑菌圈的測(cè)定

通過(guò)瓊脂打孔法測(cè)定提取液抑菌圈[19]。采用雙層平板法，即先倒入10 mL左右培養(yǎng)基，冷卻凝固后，滴加100 μL菌懸液于平板上，再倒入5 mL培養(yǎng)基充分混勻。用直徑為6 mm的瓊脂打孔器均勻打孔，各取50 μL提取液至孔中。將培養(yǎng)皿正置放于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。每組重復(fù)3次，取平均值。設(shè)置無(wú)菌水作陰性對(duì)照。

1.3.4 最低抑菌濃度

采用二倍稀釋法[20]，將迷迭香提取液(500 mg/mL)用無(wú)菌水稀釋為原液的100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125% 6個(gè)濃度(即提取液濃度分別為500.0，250.0，125.0，62.50，31.25，15.625 mg/mL)，分別吸取1 mL不同稀釋度的提取液至無(wú)菌平皿中，再加15 mL培養(yǎng)基，充分混合均勻。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，取100 μL供試菌懸液于平板上，均勻涂布。將培養(yǎng)皿倒置放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察供試菌生長(zhǎng)狀況，每組重復(fù)3次。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷迭香提取液的抑菌作用

迷迭香中含有迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚等抑菌成分，對(duì)超聲波提取的迷迭香提取液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，迷迭香提取液對(duì)食品中常見(jiàn)的腐敗菌和致病菌的抑菌效果見(jiàn)圖1。

圖1 迷迭香提取液對(duì)食品中常見(jiàn)細(xì)菌的抑菌效果

由圖1可知，迷迭香提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較好的抑菌效果，形成明顯的抑菌圈。迷迭香提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為16.4 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為19.2 mm，對(duì)表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑為33.7 mm，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為22.1 mm。

2.2 迷迭香提取液的最低抑菌濃度

采用二倍稀釋法研究迷迭香提取液的最低抑菌濃度。不同濃度的迷迭香提取液對(duì)4種供試菌的抑菌效果見(jiàn)表1和圖2。

表1 迷迭香提取液的最低抑菌濃度

圖2 不同濃度的迷迭香提取液的抑菌效果

由表1和圖2可知，通過(guò)比較不同平皿的受試菌生長(zhǎng)情況，迷迭香提取液對(duì)不同菌種有不同的最低抑菌濃度。迷迭香提取液濃度不低于62.50 mg/mL時(shí)，均可以有效地抑制受試細(xì)菌的生長(zhǎng)，當(dāng)濃度稀釋到31.25 mg/mL時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌出現(xiàn)菌落；當(dāng)濃度稀釋到15.625 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌出現(xiàn)少量的菌落。因此，迷迭香提取液對(duì)枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌作用大于對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，并且對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度為62.50 mg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度為31.25 mg/mL。

2.3 熱處理對(duì)迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

熱處理是食品加工過(guò)程中的常用工序。將迷迭香提取液分別在65，80，100，121 ℃下處理 30 min，以未處理過(guò)的提取液作對(duì)照，分別對(duì)供試菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以確定其抑菌作用的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 熱處理對(duì)迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，經(jīng)過(guò)不同溫度的熱處理，迷迭香提取液的抑菌作用變化不明顯。經(jīng)過(guò)65，80，100 ℃的熱處理，提取液對(duì)4種供試菌的抑菌圈直徑變化趨勢(shì)平緩，變化幅度不超過(guò)6.2%，抑菌作用穩(wěn)定，抑菌效果較好。121 ℃處理后，提取液的抑菌圈直徑略減小，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈減幅分別為8.5%、6.3%、9.5%、9.2%，抑菌效力略降低，但仍保持良好的抑菌效果，表明迷迭香提取液具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，能夠適應(yīng)食品加工過(guò)程中的多種熱處理?xiàng)l件。

2.4 pH對(duì)迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

不同的食品，pH也不同。用丙酸溶液和NaOH溶液將提取液的 pH 分別調(diào)為 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，以未處理的提取液(pH為6.4)作對(duì)照，分別對(duì)供試菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以確定pH對(duì)提取液抑菌作用的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，迷迭香提取液的抑菌效果受pH的影響，且變化顯著。與對(duì)照相比，當(dāng)pH值為2.0時(shí)，提取液的抑菌圈直徑明顯減小，減幅分別為大腸桿菌 32.9%、金黃色葡萄球菌37.5%、枯草芽孢桿菌34.1%、表皮葡萄球菌29.1%，抑菌活力降低明顯；當(dāng)pH值為4.0～6.0時(shí)，提取液抑菌圈直徑略有增加，抑菌活力強(qiáng)、效果好；當(dāng)pH值為8.0時(shí)，抑菌圈直徑減小，金黃色葡萄球菌減小最明顯，降幅為19.6%，表皮葡萄球菌降幅最小(8.0%)，提取液抑菌活力下降；當(dāng)pH值為10時(shí)，抑菌圈直徑顯著減小，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的減幅分別為39.5%、42.2%、21.7%、27.5%，抑菌活力顯著降低，抑菌效果較差。表明迷迭香提取液在弱酸性及中性條件時(shí)抑菌作用強(qiáng)，但是在強(qiáng)酸性、堿性環(huán)境下抑菌效果較差。因此，將迷迭香提取液應(yīng)用于食品保鮮時(shí)，應(yīng)避免強(qiáng)酸或堿性條件。

圖4 pH對(duì)迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

2.5 紫外照射對(duì)迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

將迷迭香提取液分別在紫外燈下照射10，20，30，40 min，以未處理的提取液作對(duì)照，分別對(duì)供試菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以確定紫外照射對(duì)提取液抑菌穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 紫外照射時(shí)間對(duì)迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，經(jīng)過(guò)不同時(shí)長(zhǎng)的紫外照射處理，迷迭香提取液的抑菌圈直徑變化趨勢(shì)平緩，提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑變化幅度分別小于6.3%、9.4%、8.0%、7.4%，抑菌效果基本無(wú)變化，抑菌作用穩(wěn)定。表明迷迭香提取液抑菌性對(duì)紫外照射的穩(wěn)定性較好。

2.6 金屬離子對(duì)迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

將迷迭香提取液分別加入K+、Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+等，以未處理的提取液作對(duì)照，分別對(duì)供試菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以確定金屬離子對(duì)提取液抑菌穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 金屬離子對(duì)迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，迷迭香提取液加入K+、Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+等金屬離子后，提取液的抑菌圈直徑變化趨勢(shì)平緩，變化幅度分別為大腸桿菌 6.8%、金黃色葡萄球菌8.3%、枯草芽孢桿菌5.7%、表皮葡萄球菌7.4%，抑菌活性較穩(wěn)定。表明迷迭香提取液的抑菌作用對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性較好，在加工中幾乎不受金屬離子的影響。

3 結(jié)論

迷迭香中有效抑菌成分主要是迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚等物質(zhì)。迷迭香提取液對(duì)食品中常見(jiàn)的致病菌抑制作用明顯，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為16.4 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為19.2 mm，對(duì)表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑為33.7 mm，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為22.1 mm，并且對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度為62.50 mg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度為31.25 mg/mL。

通過(guò)抑菌穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香提取液具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在酸性和中性條件下穩(wěn)定性好，但在強(qiáng)酸和堿性條件下較不穩(wěn)定，紫外和大多數(shù)金屬離子均不影響其抑菌效果，因此，迷迭香可以適應(yīng)多種加工條件，可廣泛用于食品的防腐保鮮。

迷迭香來(lái)源廣、易獲取，將迷迭香提取后經(jīng)過(guò)工藝調(diào)整運(yùn)用到食品防腐保鮮中既可改善食品感官品質(zhì)，也利于消費(fèi)者身體健康，因此開(kāi)發(fā)迷迭香防腐劑具有較好的應(yīng)用前景。