嗜熱鏈球菌MN-002發(fā)酵乳及菌粉體內(nèi)緩解小鼠疲勞功效分析

韓雨婷，陳建國，李周勇，欒少萌，康小紅

(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司， 內(nèi)蒙古 呼和浩特， 011500)

疲勞綜合癥的癥狀常包括短期記憶障礙，睡眠障礙和肌肉骨骼疼痛等，嚴重影響人們的身心健康[1]。隨著社會的快速發(fā)展，人們生活節(jié)奏也逐漸加快，長期生活壓力導致人們陷入疲勞，若無法消除或緩解,會造成癥狀加重甚至誘發(fā)其他疾病[2-3]。因此，緩解和抵抗疲勞已經(jīng)成為困擾現(xiàn)代人的一個熱點問題。

目前關(guān)于嗜熱鏈球菌多糖的生物活性研究較多，嗜熱鏈球菌衍生的胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)具有潛在的抗腫瘤、抗?jié)?、免疫調(diào)節(jié)和降低膽固醇的特性，有助于人類健康[4-5]。但關(guān)于嗜熱鏈球菌緩解體力疲勞方面的研究不多，且未見其發(fā)酵乳緩解體力疲勞功效的報道。

嗜熱鏈球菌MN-002分離于傳統(tǒng)發(fā)酵的中國乳制品，具有高產(chǎn)EPS的能力[6]。MN-002菌粉和發(fā)酵乳均有提高小鼠非特異性免疫和特異性免疫功效[7]，但對于緩解疲勞方面沒有進行過探索。因此，本試驗以嗜熱鏈球菌MN-002發(fā)酵乳和菌粉作為研究對象，通過小鼠運動模型，研究嗜熱鏈球菌MN-002緩解體力疲勞的作用，以期為益生菌資源和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

嗜熱鏈球菌MN-001、MN-002、MN-006、MN-007、MN-009和MN-012，均來源于蒙牛乳業(yè)集團研發(fā)中心菌種保藏庫。

1.1.2 實驗動物

實驗動物為SPF級昆明小鼠，雄性，平均體重為(20±2) g，共108只，隨機分為對照組、發(fā)酵乳組、菌粉組3組飼喂，購于內(nèi)蒙古大學實驗動物研究中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵乳的制備

MN-002菌株在12%(質(zhì)量分數(shù))脫脂乳培養(yǎng)基中活化3代，以2%接菌量接種于12%脫脂乳，于37 ℃發(fā)酵18 h，4 ℃冷卻6～8 h后，在M17固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h并檢測發(fā)酵乳中菌落總數(shù)，利用0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)調(diào)整其菌數(shù)為1.0×109CFU/mL，按用量分裝4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MN-002菌粉的預處理

將MN-002菌粉在M17固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h并檢測發(fā)酵劑活菌數(shù)，利用0.01 mol/L、pH 7.4的PBS調(diào)整其菌數(shù)為1.0×109CFU/mL，按用量分裝4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 產(chǎn)胞外多糖菌株能力檢測

參照王凡等[8]的實驗方法，以葡萄糖為標準溶液，葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL)X為橫坐標，吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.2.4 MN-002抗疲勞功能評價

實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d、待體重均達(20±2) g后將小鼠隨機分為3組，分組飼喂，自由飲水，自由采食。受試組小鼠每日1次灌胃，對照組以同樣的方法給予生理鹽水，連續(xù)45 d，如表1所示。

本研究通過使小鼠進行負重游泳判斷小鼠運動耐力的變化，并通過檢測小鼠血清尿素、肝糖原、血乳酸3項指標對MN-002緩解小鼠疲勞的功效進行評估。

1.2.4.1 負重游泳實驗

參考LIU等[9]的實驗方法進行小鼠負重游泳實驗，記錄小鼠自由泳開始至死亡的時間。受試樣品組負重游泳時間顯著長于對照組(P<0.05)，表明可有效緩解小鼠體疲勞，標記結(jié)果呈陽性(+)。

1.2.4.2 血清尿素氮的含量測定

參考WYBENGA等[10]檢測血清尿素氮的實驗方法。受試樣品血清尿素含量顯著低于對照組(P<0.05)，表明可有效調(diào)節(jié)血清尿素氮含量，標記結(jié)果呈陽性(+)。

1.2.4.3 肝糖原

末次給予受試樣品30 min后，處死小鼠，取肝臟。用蒽酮法試劑盒檢測肝糖原[11]。受試樣品組肝糖原含量顯著高于對照組(P<0.05)，表明可有效緩解肝糖原消耗，標記結(jié)果呈陽性(+)。

1.2.4.4 血乳酸

末次給予受試樣品30 min后，在30 ℃水中不負重游泳10 min。采3次血：第1次，游泳前采；第2次，游泳10 min后；第3次，休息20 min后。用乳酸試劑盒檢測血乳酸。計算3個時間點血乳酸曲線下面積。受試樣品組曲線下面積顯著小于對照組(P<0.05)，表明可有效緩解血乳酸產(chǎn)生，標記結(jié)果呈陽性(+)[12]。

緩解疲勞功效判定：負重游泳結(jié)果顯示陽性(+)，且血乳酸、血清尿素氮、肝糖原3項中任意2項顯示陽性(+)，可判定嗜熱鏈球菌MN-002具有緩解體力疲勞功能。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用SPSS 23統(tǒng)計軟件進行處理，采用單因素方差分析進行多組間差異比較，采用t檢驗進行兩兩比較，以P<0.05為具有統(tǒng)計學意義，實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示。

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株產(chǎn)EPS能力

2.1.1 標準曲線

由圖1可獲得葡萄糖標準曲線方程為y=0.008 1x+0.004 3，R2=0.999 2。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.1.2 菌株產(chǎn)胞外多糖檢測

如表2所示，6株菌的胞外多糖產(chǎn)量均達到90 mg/L，其中，嗜熱鏈球菌MN-002具有最強的產(chǎn)胞外多糖能力，其發(fā)酵液中EPS的含量達到了(495.72±15.86) μg/mL，約是其他菌株產(chǎn)量的5倍。

表2 菌株的EPS產(chǎn)量 單位：μg/mL

2.2 MN-002發(fā)酵乳及菌粉對小鼠體重的影響

由表3和圖2可知。3組小鼠的體重在飼喂期間不斷升高，45 d均增重約20 g，且3組間各時間點的體重都沒有顯著性差異，上升趨勢幾乎一致，結(jié)果表明，發(fā)酵乳和菌粉安全無毒，而且無其他增肥等不良效果。

表3 小鼠體重記錄表 單位：g

圖2 飼喂期間小鼠體重變化曲線(N=12)Fig.2 Weight curve of mouse during feeding(N=12)

2.3 負重游泳實驗

對運動耐力的調(diào)節(jié)作用是緩解疲勞能力加強的直接表現(xiàn)，游泳時間直接反映了小鼠的疲勞程度。由圖3可知，MN-002發(fā)酵乳和MN-002菌粉實驗組小鼠負重游泳時間均顯著長于對照組(P<0.05)，比對照組分別延長了1.08 min和2.95 min；同時菌粉組小鼠負重游泳時間顯著長于發(fā)酵乳組(P<0.05)。發(fā)酵乳組和菌粉組負重游泳實驗均顯示為陽性，而且菌粉組要比發(fā)酵組具備更優(yōu)的抗疲勞能力。

圖3 小鼠游泳時間變化Fig.3 Swimming time of mouse注：N=12；*代表本組與對照組相比有顯著差異(P<0.05)；#代表本組分別與對照組、MN-002發(fā)酵乳組相比有顯著差異(P<0.05)(下同)

2.4 肝糖原實驗

由圖4可知，發(fā)酵乳實驗組和菌粉實驗組肝糖原含量顯著高于對照組(P<0.05)，分別有59.9%和88.0%的增量；此外，菌粉組肝糖原含量比發(fā)酵乳組顯著高出17.5%(P<0.05)。發(fā)酵乳組和菌粉組肝糖原實驗均顯示陽性，但菌粉抗疲勞效果略優(yōu)于發(fā)酵乳。

圖4 肝糖原含量變化Fig.4 Hepatic glycogen content changes

2.5 血清尿素氮實驗

圖5結(jié)果顯示MN-002發(fā)酵乳和菌粉組小鼠的血清尿素氮均顯著低于對照組(P<0.05)，分別比對照組降低了25.4%和15.6%；而且發(fā)酵乳組與菌粉組的血清尿素氮含量水平并沒有顯著差異(P>0.05)。該結(jié)果表明，發(fā)酵乳組和菌粉組血清尿素氮實驗結(jié)果均顯示為陽性，且發(fā)酵乳和菌粉調(diào)節(jié)血清尿素含量的效果相近。

圖5 血清中尿素含量變化Fig.5 Changes in serum urea content注：N=12；*表示本組與對照相比差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6 血乳酸實驗

由圖6可知，發(fā)酵乳實驗組血乳酸曲線下面積顯著降低了7.2%(P<0.05)；菌粉實驗組血乳酸曲線面積與對照組相比也顯著降低(P<0.05)。菌粉和發(fā)酵乳顯著降低血乳酸含量。

綜上，得出判定結(jié)果如表4所示，MN-002菌粉和發(fā)酵乳組負重實驗及3項輔助生化指標均顯著變化，因此，MN-002菌粉和發(fā)酵乳的抗疲勞結(jié)果均判定為陽性。

圖6 血乳酸曲線下面積柱形圖Fig.6 Area column chart under blood lactate curve

表4 試驗結(jié)果判定表Table 4 Result determination

3 討論

疲勞的定義是工作學習過程中執(zhí)行能力降低和達成效率降低的狀態(tài)。同時會伴隨身體或心理疲憊的感覺[9]，而運動則是導致身體疲勞的關(guān)鍵因素之一。運動耐力直接且客觀反映了疲勞程度[13]，負重游泳試驗結(jié)果表明，發(fā)酵乳和菌粉組小鼠負重游泳時間較對照組顯著延長(P<0.05)，說明嗜熱鏈球菌MN-002能夠提高小鼠的運動耐力，具有一定的延緩疲勞活性，同時，其作為菌粉的抗體力疲勞效果顯著優(yōu)于發(fā)酵乳。

肌糖原的分解是運動能量的初始來源，劇烈運動會產(chǎn)生能量耗盡，后期的能量則主要來自肝糖原[14]。肝糖原是疲勞狀態(tài)的敏感指標。結(jié)果顯示，嗜熱鏈球菌MN-002可減緩運動過程中肝糖原消耗，進而延緩疲勞產(chǎn)生，提高運動耐受力，有助于改善運動的代謝控制和能量代謝的激活[15]。同樣，菌粉組的調(diào)節(jié)效果顯著優(yōu)于發(fā)酵乳，與負重游泳實驗結(jié)果相一致。肝糖原的積累可能是導致運動耐受能力增加的關(guān)鍵因素。

通過無氧糖酵解，運動過程中獲取能量的同時，體內(nèi)會產(chǎn)生和積累大量代謝產(chǎn)物，包括乳酸[16]。尿素在肝臟中形成，是蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物，其含量與運動耐量呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系。即血清尿素含量越高，表明機體適應(yīng)運動耐受性越弱[17]。因此，血乳酸和血清尿素氮都是緩解疲勞的重要檢測指標。發(fā)酵乳組血清尿素氮和血乳酸含量顯著下降，說明MN-002發(fā)酵乳和菌粉有效降低了蛋白質(zhì)的分解代謝，延緩了乳酸在體內(nèi)的堆積，增加了運動負荷的適應(yīng)能力，加速代謝產(chǎn)物清除，促進疲勞恢復。

嗜熱鏈球菌MN-002可產(chǎn)生大量EPS，是其他菌株產(chǎn)量的近5倍，包含76%～81%的酸性EPS和12%～16%的中性EPS。多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、抗腫瘤、抗氧化等生物活性[18-21]，可通過促進糖原合成、減少運動代謝產(chǎn)物、增加耐缺氧能力等來提高機體的抗疲勞能力，對于預防與消除運動性疲勞有重要作用[22]。枸杞、五味子和黃芪多糖對正常小鼠具有抗疲勞效果，最低有效劑量均<50 mg/(kg·d)，而人參、土黨參和黃秋葵多糖的有效劑量均為100 mg/(kg·d)[23-26]。推測EPS可能是嗜熱鏈球菌MN-002提高小鼠運動耐力、增加肝臟中肝糖元儲備量、降低血乳酸、血清尿素氮含量的功能因子，其發(fā)揮功能的具體分子機制需要進一步探究。

4 結(jié)論

綜上所述，6株乳酸菌中嗜熱鏈球菌MN-002產(chǎn)胞外多糖能力最強，高達495.72 μg/mL，顯著高于其他菌株；在不影響小鼠體重的前提下，高產(chǎn)胞外多糖的MN-002發(fā)酵乳和菌粉均有緩解小鼠體力疲勞的功效，活菌數(shù)有效劑量均為2×108CFU/d；相較于發(fā)酵乳組，菌粉組抗疲勞和調(diào)節(jié)肝糖原的效果更優(yōu)，而發(fā)酵乳組調(diào)節(jié)血乳酸的效果更好，它為嗜熱鏈球菌MN-002的應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。