厚樸酚對腦卒中后抑郁小鼠神經(jīng)炎癥及HPA軸的影響

趙欣，姬孟艷，董強(qiáng)

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）常在卒中發(fā)生后數(shù)周至數(shù)月出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為情緒低落和興趣下降，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，死亡率及自殺率較高[1]，應(yīng)及早進(jìn)行干預(yù)及治療。PSD的發(fā)病機(jī)制主要包括以下兩種[2]：一是內(nèi)源性機(jī)制，卒中病灶引起單胺類神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平下降；其次是反應(yīng)性機(jī)制，腦損害引起下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamuspituitary-adrenal，HPA）軸功能紊亂，調(diào)節(jié)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致PSD。厚樸酚是從木蘭科植物厚樸及凹葉厚樸的干燥干皮、枝皮和根皮中提取的一種含酚羥基的活性物質(zhì)，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、肌肉松弛等作用[3,4]。因此，本文就厚樸酚對PSD 小鼠的神經(jīng)炎性因子及HPA軸的作用進(jìn)行研究，探討其在PSD中的臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 厚樸酚由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，鹽酸氟西汀分散片（20 mg/片）購于禮來（蘇州）制藥有限公司，阿司匹林片（50 mg/片）購于舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司。

1.1.2 動物 健康雄性SPF級ICR小鼠，體質(zhì)量25～28 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物服務(wù)有限公司。在本院動物中心標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲食，12 h/12 h晝夜節(jié)律。本研究經(jīng)過浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.3 主要儀器與試劑 全自動酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)購于美國Beckman 公司；BiometraUnio ⅡPCR 儀購于德國Biometra 公司；UV260 紫外分光光度儀購于日本Shimadzu 公司；Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph 顯微圖像分析系統(tǒng)購于日本Olympus 公司。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 檢測試劑盒購于南京建成生物科技有限公司；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）試劑盒、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）試劑盒、皮質(zhì)醇（cortisol，COR）試劑盒均由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 參照改良Koizumi 法[2]制作大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，頸部正中切口，鈍性分離右頸總動脈（common carotid artery，CCA）主干、頸總分叉、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA），結(jié)扎CCA 主干和ECA 近心端，在CCA 主干遠(yuǎn)端及ICA 根部穿線備用，用微動脈夾暫時夾閉ICA 遠(yuǎn)端，在距CCA 分叉部3～4 mm處用眼科剪剪一小口，插入線栓，使線栓從CCA順行進(jìn)入ICA，松開ICA的微動脈夾，使線栓略呈弧形，向外上方的角度緩慢順著ICA走向插入，插入深度約為18～20 mm（從CCA分叉處計(jì)算），當(dāng)線栓到達(dá)大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）起始段，將阻斷進(jìn)入MCA的血流，引起局灶性腦缺血改變。結(jié)扎CCA主干遠(yuǎn)端及ICA根部備線，防止線栓脫落，剪斷多出的栓線。生理鹽水清洗，消毒棉球清潔手術(shù)野，逐層縫合。注射用青霉素鈉鹽4萬U/只腹腔注射，預(yù)防術(shù)后感染[2,3]。小鼠單籠孤養(yǎng)，術(shù)后恢復(fù)7 d，再給予28 d 慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS），包括禁食、禁水、行為限制、潮濕墊料、晝夜顛倒、傾籠、夾尾7種刺激方法，每種方法使用4次，隨機(jī)分布于4個應(yīng)激周期中，制作PSD模型。

1.2.2 分組 采用蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)和曠場試驗(yàn)行為評分，篩選出行為評分較均一的小鼠，隨機(jī)分為對照組、PSD 組、陽性藥物組、厚樸酚組。補(bǔ)充大腦中動脈栓塞后、應(yīng)激中、實(shí)驗(yàn)過程中不可阻擋因素致死的小鼠，最終每組20 只。對照組進(jìn)行MCAO 手術(shù)，但不夾閉MCA；其余3組給予MCAO造模術(shù)聯(lián)合CUMS。除對照組，其余各組應(yīng)激造模28 d，且于應(yīng)激時給藥，對照組蒸餾水灌胃，厚樸酚組給予厚樸酚灌胃，陽性藥物組給予鹽酸氟西?。⑺酒チ炙幑辔浮＝o藥量均為10 mL/kg，每日1次，總共28 d。

1.2.3 檢測指標(biāo) 造模28 d后，取出小鼠大腦，通過酶聯(lián)免疫試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，放免法檢測CRH、ACTH、CORH表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，單因素方差分析，LSD多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重變化比較

造模前1 d、造模第21 天、第28 天，對照組、PSD 組、陽性藥物組、厚樸酚組4組體質(zhì)量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較（g，±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較（g，±s）

組別對照組PSD組陽性藥物組厚樸酚組只數(shù)20 20 20 20造模前1 d 25.64±1.21 25.13±2.13 25.41±1.34 25.64±2.17造模第21天26.34±2.12 27.89±1.34 29.14±3.12 27.16±3.11造模第28天28.21±1.02 29.31±2.15 28.33±1.22 29.88±1.02

2.2 各組炎性因子表達(dá)比較

與對照組相比，PSD 組小鼠腦IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)明顯增加（P＜0.05），陽性藥物組和厚樸酚組的小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)下降（P＜0.05），陽性藥物組和厚樸酚組相比上述3個指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL6比較（±s）

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL6比較（±s）

注：與對照組相比，①P＜0.05；與PSD組相比，②P＜0.05

組別對照組PSD組陽性藥物組厚樸酚組只數(shù)20 20 20 20 TNF-α 2.1±0.6 3.3±0.7①2.5±0.6①②2.7±0.4①②IL-1β 1.4±0.6 2.8±0.6①2.4±0.5①②2.3±0.4①②IL6 1.5±0.4 3.3±0.6①2.2±0.5①②2.4±0.8①②

2.3 HPA軸相應(yīng)激素的變化

與對照組相比，PSD 組、陽性藥物組、厚樸酚組的CRH、ACTH、腎上腺及血清CORT明顯上升（P＜0.05）；與PSD組相比，陽性藥物組、厚樸酚組的CRH、ACTH、腎上腺及血清CORT明顯下降（P＜0.05）；與陽性藥物組相比，厚樸酚組的CRH、ACTH、腎上腺及血清CORT表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組小鼠HPA相關(guān)激素含量比較（±s）

表3 各組小鼠HPA相關(guān)激素含量比較（±s）

注：與對照組相比，①P＜0.05；與PSD組相比，②P＜0.05

組別對照組PSD組陽性藥物組厚樸酚組只數(shù)20 20 20 20 CRH/(ng/mL)0.80±0.29 1.16±0.22①0.97±0.31①②0.88±0.26①②ACTH/(pg/mL)3.69±0.25 4.85±0.68①4.78±0.25①②4.72±0.15①②組別對照組PSD組陽性藥物組厚樸酚組腎上腺CORT/(ng/mL)27.15±5.78 42.82±5.64①31.52±4.16①②29.43±4.35①②血清COR/(ng/mL)235.42±8.67 275.18±24.31①265.20±9.75①②255.30±8.46①②

3 討論

PSD是指腦卒中后發(fā)生的情緒低落，疲乏無力，失眠多夢，是一種常見的繼發(fā)性抑郁，發(fā)病率約為18%～78%[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥通路和炎癥介質(zhì)與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。神經(jīng)炎性反應(yīng)是由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多種炎性反應(yīng)因子導(dǎo)致的細(xì)胞和組織損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死，加劇病情進(jìn)展。缺血引起的神經(jīng)元死亡激活了缺血區(qū)域的免疫運(yùn)輸并導(dǎo)致大腦和外周免疫功能的轉(zhuǎn)變。腦梗死時，外周血免疫細(xì)胞通過受損的血腦屏障遷移至梗死部位，分泌多種炎癥因子、促炎介質(zhì)，產(chǎn)生免疫反應(yīng)[6]。同時，這些炎性因子產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)，引起機(jī)體功能障礙和氧化應(yīng)激[7]。炎癥在抑郁癥發(fā)生中起重要作用。首先，抑郁樣行為在感染動物中很常見。其次，情緒障礙常在感染后出現(xiàn)。使用促炎細(xì)胞因子治療的患者往往會發(fā)展為抑郁癥。炎癥在PSD的發(fā)生中至關(guān)重要，其可作為PSD 的一個治療靶點(diǎn)，而與二甲雙胍相比，吡格列酮治療可減少糖尿病患者的PSD。因吡格列酮具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)的作用。最近的繼發(fā)性腦卒中預(yù)防試驗(yàn)中，吡格列酮降低胰島素抵抗患者的CRP。這提示腦卒中后免疫反應(yīng)的抑制可以預(yù)防PSD的發(fā)生。

HPA軸的功能與PSD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。生理情況下，HPA 軸可維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，參與人體行為、情緒的協(xié)調(diào)以適應(yīng)外界壓力、刺激等的變化[8,9]。下丘腦控制中樞神經(jīng)內(nèi)分泌功能，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)與身體其他部位之間的主要中介。陳宇等[10]發(fā)現(xiàn)PSD患者體內(nèi)HPA軸負(fù)反饋中樞海馬明顯減小，并有研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥早期患者左側(cè)海馬體積較健康人下降[11]。可見，PSD與HPA軸功能異常密切相關(guān)。卒中后常出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，引起COR和兒茶酚胺水平升高。腦卒中后腎上腺水平的HPA軸異?？赡茉谧渲泻笤缙诎l(fā)生，并與預(yù)后相關(guān)。PSD患者HPA軸興奮，引起體內(nèi)谷氨酸升高及γ-氨基丁酸降低，進(jìn)而神經(jīng)細(xì)胞損傷增加，恢復(fù)減弱，從而形成惡性循環(huán)。運(yùn)動訓(xùn)練作為康復(fù)治療的常見方法，廣泛應(yīng)用在臨床的各項(xiàng)治療中。既往研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動訓(xùn)練可降低HPA 軸的興奮作用，加大調(diào)節(jié)能力，促進(jìn)PSD 患者病情的恢復(fù)。吳奇勇等[12]對PSD患者進(jìn)行精細(xì)動作訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)其對PSD 患者的康復(fù)具有促進(jìn)作用。抑郁患者中由HPA 軸產(chǎn)生的炎癥和促炎癥因子表達(dá)升高[13]，可激活HPA軸，產(chǎn)生正反饋，改變神經(jīng)傳導(dǎo)。炎癥反應(yīng)改變機(jī)體的內(nèi)分泌功能，降低單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平，進(jìn)而導(dǎo)致PSD[14]。

厚樸酚是中草藥厚樸的主要活性成分，具有抗免疫、抗氧化、鎮(zhèn)痛消炎等作用。本研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚能有效抑制腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，降低應(yīng)激對HPA 軸產(chǎn)生的刺激作用，減少炎性因子等的表達(dá)，改善PSD 小鼠體內(nèi)神經(jīng)炎性反應(yīng)，為PSD 的臨床治療提供了新的思路。本研究中，陽性藥物組與厚樸酚組較PSD組，出現(xiàn)IL-1β、IL-6等炎癥因子表達(dá)下降，陽性藥物組與厚樸酚組則無明顯差異，提示厚樸酚與阿司匹林及氟西汀均可降低小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，具有抗炎的作用。與對照組相比，PSD組、陽性藥物組、厚樸酚組的CRH、ACTH、腎上腺及血清CORT明顯上升，提示PSD引起的應(yīng)激可導(dǎo)致HPA軸興奮，并引起相應(yīng)激素水平升高。與PSD組相比，陽性藥物組、厚樸酚組的CRH、ACTH、腎上腺及血清CORT明顯下降，與陽性藥物組相比，厚樸酚組的CRH、ACTH、腎上腺及血清CORT表達(dá)水平對比無明顯差異，提示厚樸酚同阿司匹林及氟西汀一樣，也可調(diào)節(jié)HPA 軸的功能，降低PSD 對小鼠HPA 軸的刺激，有利于病情的恢復(fù)。本研究也存在一些局限性。本研究樣本量較小，所得結(jié)果難免存在誤差；測量指標(biāo)較少，難免存在偏倚。未來期待大樣本量、更精確的測量儀器及指標(biāo)使結(jié)果更具可靠性。