間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的研究進(jìn)展

吳玲姍，喻志源，駱翔

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后缺乏持續(xù)性的修復(fù)和再生能力，探尋一種促進(jìn)大腦和脊髓神經(jīng)修護(hù)的治療方法是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植療法是一種有效的治療方法。干細(xì)胞是一種具有再生各種組織器官潛能的組織細(xì)胞，而MSCs 是成體干細(xì)胞的重要成員之一，是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，來(lái)源廣泛、獲取容易、免疫原性低[1,2]。MSCs 移植治療的基本原理是促進(jìn)移植的MSCs 進(jìn)行分化，取代死亡神經(jīng)元。最新研究表明，由MSCs 釋放的外泌體在治療缺血性腦卒中、創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）和其他神經(jīng)退行性疾病中具有重要意義[3,4]。外泌體是納米級(jí)雙層磷脂膜囊泡小體，廣泛存在于體液和各種細(xì)胞中，細(xì)胞通過(guò)外泌體主動(dòng)分選機(jī)制將特定細(xì)胞內(nèi)容物，如多種特異性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)包裹于其內(nèi)，與受體細(xì)胞靶向融合，參與細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及信息交流，在多種生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。本文綜述外泌體在大腦細(xì)胞間信號(hào)傳遞中的最新進(jìn)展，并探討MSCs 外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中作用的研究進(jìn)展。

1 外泌體的生物學(xué)特性和功能

外泌體幾乎是所有細(xì)胞均可分泌的一種膜性囊泡結(jié)構(gòu)，直徑約為30～150 nm，包含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸（如mRNA、microRNA、LncRNA、DNA）等生物信息[6]。由于其穩(wěn)定的脂質(zhì)雙分子層，外泌體能夠在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移其生物活性分子，從而參與細(xì)胞間通訊[6]。外泌體的這些內(nèi)含物中，microRNA（miRNA）的作用尤為重要，外泌體中miRNA的含量最高，高達(dá)41.7%[7]。miRNA 是一類長(zhǎng)度約為22 nt、進(jìn)化保守的非編碼RNA 分子，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[8]。成熟的miRNA 通過(guò)降解目的mRNA 或抑制翻譯引起基因沉默，從而對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遺傳性狀進(jìn)行調(diào)控。

2 外泌體與血腦屏障的關(guān)系

大多數(shù)藥物無(wú)法通過(guò)血腦屏障，這是神經(jīng)疾病在治療方面所面臨的一大挑戰(zhàn)。研究表明，外泌體可以穿過(guò)血腦屏障發(fā)揮作用。將攜帶CD63-GFP的外泌體注入動(dòng)物體內(nèi)，一段時(shí)間后可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和大腦內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生了熒光信號(hào)[9]。經(jīng)鼻飼給藥后，無(wú)創(chuàng)體內(nèi)CT 顯示標(biāo)記有金納米顆粒的基質(zhì)細(xì)胞外泌體成功進(jìn)入健康小鼠大腦。局灶性腦缺血損傷處理后，這些標(biāo)記的外泌體則聚集在缺血灶周圍[10]。借由放射性元素標(biāo)記方法，巨噬細(xì)胞外泌體被發(fā)現(xiàn)同樣可通過(guò)血腦屏障[11]。目前認(rèn)為外泌體穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)有兩種機(jī)制：第一種，外泌體可能通過(guò)胞吞作用被內(nèi)皮細(xì)胞吸收，最終轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞[12]；第二種，外泌體可能通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間隙進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[13]。

3 MSCs 外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用研究

MSCs外泌體能夠產(chǎn)生類似于來(lái)源MSCs 的再生與修復(fù)潛能，這一功能己經(jīng)在多種動(dòng)物疾病模型中得到證實(shí)。Zhang 等[3]與Xin 等[4]分別首次報(bào)道MSCs外泌體在TBI和缺血性腦卒中動(dòng)物模型中的治療潛力。這些研究表明，靜脈注射MSCs 外泌體治療缺血性腦卒中或TBI的大鼠模型，與MSC移植治療相比，可同樣顯著地促進(jìn)神經(jīng)血管再生，改善恢復(fù)期的行為和認(rèn)知結(jié)果[3,4]。隨后，Doeppner等[14]對(duì)這兩種治療方法進(jìn)行直接比較，結(jié)果表明缺血性腦卒中小鼠中MSCs 移植療法或MSCs 外泌體療法可同等改善運(yùn)動(dòng)功能。在腦出血大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，MSCs 外泌體療法可改善腦出血后感覺(jué)運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能的恢復(fù)[15,16]。Cui 等[17]在APP/PS1 小鼠阿爾茲海默癥疾病模型中發(fā)現(xiàn)MSC外泌體可以促進(jìn)Aβ降解、減緩認(rèn)知功能下降。缺氧預(yù)處理的MSC 則會(huì)增強(qiáng)這些效應(yīng)。Katsuda 等[18]發(fā)現(xiàn)脂肪源性MSCs 外泌體富含腦啡肽酶，可促進(jìn)Aβ降解，而Aβ沉積正是阿爾茲海默癥病理改變的核心機(jī)制之一。Lee 等[19]發(fā)現(xiàn)人類脂肪MSCs 外泌體可減少亨廷頓蛋白的聚集、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白、保護(hù)線粒體，表明其在治療亨廷頓病方面具有一定的潛力。另外也有研究探討MSCs 外泌體在治療產(chǎn)前腦損傷方面的治療能力。這些研究表明，MSCs外泌體有助于甚至介導(dǎo)MSCs 的移植治療。然而，MSCs 外泌體是否表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體分子尚不清楚，因此需要更多的研究來(lái)系統(tǒng)地評(píng)價(jià)外泌體對(duì)宿主免疫反應(yīng)的影響。

3.1 直接作用

神經(jīng)修復(fù)治療的主要目的是直接作用于健康的腦細(xì)胞，促進(jìn)大腦自我修復(fù)[20]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，MSC外泌體通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突和軸突的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[21]。

3.2 間接作用

研究表明，外源性外泌體除了對(duì)腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能有直接影響外，還有間接的神經(jīng)恢復(fù)作用。在大鼠局灶性腦缺血模型中，MSC 外泌體可刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放外泌體，而后者可促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)，這表明星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體可協(xié)助MSC外泌體對(duì)腦缺血后神經(jīng)突觸重塑[22]。由此可見(jiàn)，MSC外泌體可作用于受體細(xì)胞，促進(jìn)后者釋放外泌體，參與細(xì)胞之間通訊交流，從而促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。

3.3 調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)

缺血性腦卒中和TBI等神經(jīng)疾病會(huì)引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，從而加劇腦損傷。臨床研究表明，循環(huán)中的內(nèi)源性外泌體可能加劇缺血性腦卒中引發(fā)的炎癥反應(yīng)。急性腦卒中患者外周血中的外泌體富含C反應(yīng)蛋白，此外，這些外泌體可以激活巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)后者高表達(dá)細(xì)胞因子和趨化因子[23]；這些高表達(dá)的細(xì)胞因子和趨化因子與腦卒中后不良預(yù)后有關(guān)[23]。而一些臨床前研究表明MSC 外泌體可以抑制炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)在缺血性腦損傷小鼠模型中，盡管MSC外泌體對(duì)大腦免疫細(xì)胞浸潤(rùn)無(wú)影響，但可減弱缺血后免疫抑制反應(yīng)[14]。

3.4 系統(tǒng)性作用

雖然外泌體在治療缺血性腦卒中和TBI等神經(jīng)疾病中的靶器官是大腦，但一些證據(jù)表明其作用可能不僅僅局限于大腦。在嚙齒動(dòng)物腦缺血模型中，大腦內(nèi)皮細(xì)胞外泌體可以加劇心臟功能衰竭[24]，表明外泌體在器官水平存在相互影響。同樣，有研究表明，外周細(xì)胞源性外泌體可以引起外周炎癥和大腦炎癥的相互作用。MSC外泌體是否也有同樣的系統(tǒng)性作用還待進(jìn)一步研究。

4 MSCs外泌體的作用機(jī)制

外泌體與受體細(xì)胞的質(zhì)膜或內(nèi)吞膜融合，隨后將其攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，而外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的這些物質(zhì)可能改變了受體細(xì)胞的功能[25]。

4.1 miRNA的作用

遺傳學(xué)研究表明，miRNA 可以改變受體細(xì)胞的功能，并在MSC外泌體的治療中發(fā)揮效應(yīng)[26]。利用基因工程修飾的外泌體來(lái)傳遞特定的miRNA用于治療腦卒中的研究正在積極進(jìn)行中。研究發(fā)現(xiàn)，與未修飾的MSCs 外泌體相比，過(guò)表達(dá)miR-133b 或miR-17-92 的MSCs 外泌體在治療大鼠缺血性腦卒中和腦出血時(shí)，對(duì)抑制軸突生長(zhǎng)的靶蛋白可發(fā)揮更強(qiáng)的抑制作用，并抑制導(dǎo)致神經(jīng)元死亡基因的表達(dá)，從而促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)發(fā)生[4,27]。

4.2 特異性靶基因

miRNA 與靶基因的關(guān)系，可以是一一對(duì)應(yīng)的，即某個(gè)特定miRNA調(diào)節(jié)一個(gè)特殊的靶基因，進(jìn)而影響到一條特定的信號(hào)通路；同時(shí)miRNA 和靶基因的關(guān)系也可以是多元的，即一個(gè)miRNA 可調(diào)控體內(nèi)多個(gè)靶基因，或者多個(gè)miRNA 可調(diào)控同一個(gè)靶基因。在大鼠缺血性腦卒中模型中，Xin等[4]通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MSC 外泌體中的miR-133b 可分別作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞靶基因——結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）和神經(jīng)元靶基因——ras基因家族A，當(dāng)缺血性損傷發(fā)生后，miR-133b使缺血區(qū)域的CTGF和RohA表達(dá)減少，從而減少缺血區(qū)域內(nèi)膠質(zhì)瘢痕增生、促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，從而促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。這表明特定miRNA 在發(fā)揮作用時(shí)具有細(xì)胞特異性，還可能存在協(xié)同機(jī)制。Zhang等[21]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MSCs外泌體中的miR-17-92可靶向抑制神經(jīng)元中PTEN基因（mTOR信號(hào)通路相關(guān)的一種內(nèi)源性軸突再生負(fù)調(diào)節(jié)因子）的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、加速神經(jīng)修復(fù)。

4.3 蛋白質(zhì)的作用

除了miRNA，蛋白質(zhì)在MSCs外泌體的治療中也發(fā)揮著重要作用。在大鼠腦出血模型中，Otero-Ortega等[15]通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MSCs 外泌體中存在多種參與大腦功能修復(fù)的蛋白，如突觸囊泡膜蛋白（vesicle membrane protein，VAT1）、突觸結(jié)合蛋白-11（synaptotagmin-11，SYT11）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)纖毛蛋白2（neuropilin-2，NRP2）等。

5 總結(jié)

臨床前研究表明，無(wú)論是天然外泌體或是修飾過(guò)的MSCs外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都有強(qiáng)有力的治療作用，目前，正在研究以人細(xì)胞外囊泡為基礎(chǔ)的治療方案，特別是人MCS 外泌體[28]。但是基于MSC 外泌體的臨床治療轉(zhuǎn)化仍面臨著挑戰(zhàn)。目前尚不清楚MSC外泌體治療的確切細(xì)胞和分子機(jī)制，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)仍有待建立，以確保外泌體產(chǎn)品的一致性和可重復(fù)性，以優(yōu)化工程，使臨床效益最大化，這些都亟待進(jìn)一步的研究完善。為解決這些問(wèn)題，在基礎(chǔ)研究方面，需要對(duì)MSC外泌體中miRNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行深入的研究分析，以明確外泌體作用的分子機(jī)制；在實(shí)踐中，需要充分考慮安全性，并著重研究修飾過(guò)的MSC外泌體，使其定向作用于預(yù)期的靶點(diǎn)，達(dá)到最大的治療效益。