• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    發(fā)酵殼聚糖產(chǎn)酒精的微生物篩選及條件優(yōu)化

    2020-12-01 08:24:28王海東李慶立陳文武李清秀劉紹鵬
    發(fā)酵科技通訊 2020年4期
    關(guān)鍵詞:幾丁質(zhì)重鉻酸鉀殼聚糖

    王海東,李慶立,陳文武,李清秀,賀 峰,劉紹鵬

    (徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥品食品學(xué)院,江蘇 徐州 221006)

    幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β(1-4)糖苷鍵連接成的高分子聚合物,廣泛存在于自然界,據(jù)統(tǒng)計(jì),幾丁質(zhì)全球年生物合成量超過10億噸,是僅次于纖維素的第二大可再生資源,主要存在海洋中,還有來源于養(yǎng)殖的蝦蟹和昆蟲的殼,真菌細(xì)胞壁,藻類等[1]。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物為殼聚糖、幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖等,可廣泛應(yīng)用于制藥、食品和工業(yè)原料等領(lǐng)域[2]。對幾丁質(zhì)的研究主要集中在提高幾丁質(zhì)的降解效率[3],尋找更高效的幾丁質(zhì)降解酶[4]、幾丁質(zhì)脫乙酰酶[5],而以幾丁質(zhì)降解脫乙酰的產(chǎn)物殼聚糖為原料發(fā)酵生成酒精的研究,尚沒有相關(guān)報道,筆者希望通過篩選獲得直接發(fā)酵殼聚糖產(chǎn)生酒精的菌株,為幾丁質(zhì)的降解和綜合利用做有益的探索。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 樣 品

    采集徐州市云龍湖底淤泥作為樣品,以其中的自然菌種為篩選對象。

    1.1.2 試 劑

    殼聚糖Chitosan,上海伊卡生物技術(shù)有限公司,水溶,脫乙酰度≥95%,分子量≤50 kD;

    質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的重鉻酸鉀溶液,配制方法為稱取5 g的重鉻酸鉀AR溶于50 mL水中,加10 mL濃硫酸,冷卻,加水至100 mL,pH自然[6]。

    1.1.3 培 養(yǎng) 基

    基礎(chǔ)培養(yǎng)基:殼聚糖10 g,蛋白胨10 g,115 ℃,瓊脂15 g,水1 000 mL,滅菌30 min。

    篩選培養(yǎng)基:殼聚糖10 g,瓊脂15 g,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.5 g,水1 000 mL,pH自然,115 ℃,滅菌30 min[7-8]。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:殼聚糖100 g,水1 000 mL,分裝在100 mL發(fā)酵瓶中,每瓶50 mL,pH自然,115 ℃滅菌30 min。

    1.1.4 儀 器

    恒溫?fù)u床BDY-100B,上海予卓儀器有限公司;分光光度計(jì)T6,上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

    1.2 方 法

    1.2.1 產(chǎn)酒精菌株的高通量篩選

    稱取淤泥樣品1 g,加入10 mL無菌水,梯度稀釋106倍涂布基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板,30 ℃,培養(yǎng)2 d。待長出菌落后,把篩選培養(yǎng)基融化,冷卻至45 ℃左右,倒在平板上,覆蓋在菌落上層,30 ℃,避光培養(yǎng)3 h[9]。因內(nèi)含2,3,5-氯化三苯基四氮唑TTC作為顯色劑,如果環(huán)境菌株具有降解殼聚糖的呼吸酶活力,會發(fā)生紅色或粉紅色顯色反應(yīng),以完成菌種的高通量初篩。

    劃線分離有顏色反應(yīng)的菌株,挑取單菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃搖床培養(yǎng),觀察是否有大量氣泡產(chǎn)生,用重鉻酸鉀溶液檢測是否產(chǎn)生酒精進(jìn)一步驗(yàn)證[10-11],完成對菌種的復(fù)篩。

    1.2.2 菌株鑒定

    菌株提取總DNA后交由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行ITS序列鑒定和Blast比對,結(jié)合菌株的形態(tài)和發(fā)酵特性分析菌株的種屬。

    1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

    以體積分?jǐn)?shù)1%固定接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基,開展單因素實(shí)驗(yàn),確定發(fā)酵殼聚糖生成酒精的最適pH、溫度、時間和轉(zhuǎn)速等參數(shù),設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化,以獲得最優(yōu)發(fā)酵條件。

    1.2.4 乙醇質(zhì)量濃度的測定

    1) 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

    取0.25 mL優(yōu)級無水乙醇于100 mL容量瓶中,加水至刻度線,該溶液含乙醇質(zhì)量濃度2 mg/mL。取6支刻度一致的10 mL比色管,編號為1~6,每支比色管中加入重鉻酸鉀溶液2 mL,分別加入乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0,1,2,4,6,8 mL,加水至刻度線,配制不同質(zhì)量濃度的乙醇溶液,100 ℃水浴10 min,流水冷卻5 min,以1號管作對比,用1 cm比色皿,于波長600 nm處測定吸光度,以乙醇濃度與對應(yīng)吸光度A的工作曲線[12-13]。

    2) 發(fā)酵液中酒精質(zhì)量濃度的測定

    取發(fā)酵液0.5 mL于10 mL比色管中,加入2 mL重鉻酸鉀溶液,加水至刻度線,空白管以1號管作空白,于波長600 nm處測定吸光度,平行3次,取平均值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出乙醇的質(zhì)量濃度[14]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌種篩選與鑒定

    經(jīng)多輪初篩和復(fù)篩,得到一株能夠發(fā)生顏色反應(yīng)的菌株,劃線分離得到單菌落,菌株命名為K-6。對菌株的ITS序列,NCBI收錄號為MT501695,進(jìn)行Blast比對分析,結(jié)果顯示與收錄的S.cerevisiae釀酒酵母菌株MUCL28071的ITS序列有最高99.18%的相似度。菌株的菌落形態(tài)呈圓形,表面凸起,光滑濕潤,粘稠,容易挑起,乳白色泛黃,顏色質(zhì)地均勻,不透明,邊緣整齊,特征如圖1所示。

    圖1 菌株K-6的菌落特征Fig.1 The colony characteristics of strain K-6

    經(jīng)過顯微鏡檢測,其形態(tài)為單個菌,卵圓形,可觀察到出芽生殖,無菌絲,形態(tài)如圖2所示。

    圖2 菌株K-6的顯微鏡下形態(tài)Fig.2 The microscopic morphology of strain K-6

    將篩選培養(yǎng)基融化冷卻至42 ℃左右,用接種針取少量菌,接入培養(yǎng)基混勻傾倒平板,30 ℃培養(yǎng)觀察,發(fā)現(xiàn)其能夠穩(wěn)定產(chǎn)生紅色反應(yīng)(圖3),推測菌株K-6能夠利用殼聚糖作為營養(yǎng)物質(zhì),有呼吸酶作用[15-16],能夠還原TTC產(chǎn)生紅色不溶物質(zhì)三苯甲月替(TTF)。

    圖3 菌株K-6的TTC篩選培養(yǎng)基顏色反應(yīng)Fig.3 The color reaction of TTC screening medium of strain K-6

    將菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃,發(fā)酵瓶培養(yǎng),觀測到有大量氣體產(chǎn)生,并有輕微酒精氣味散出,初步確定發(fā)酵液中應(yīng)該有酒精成分產(chǎn)生;同時檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液與重鉻酸鉀溶液能夠產(chǎn)生明顯的綠色特征反應(yīng),相互驗(yàn)證確定發(fā)酵液體中有酒精組分生成,說明菌株K-6能夠以可溶性殼聚糖為底物直接發(fā)酵產(chǎn)生酒精。通過ITS分子鑒定,結(jié)合菌落形態(tài),生殖方式,顯色反應(yīng),以及可發(fā)酵產(chǎn)生酒精的特性,可確定菌株K-6應(yīng)屬于釀酒酵母S.cerevisiae。

    2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

    以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基,選定溫度、pH、發(fā)酵時間和攪拌轉(zhuǎn)速4個因素做單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),采用比色法,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線測定產(chǎn)生酒精的質(zhì)量濃度。以溫度為變量因素,自然pH、時間3 d和轉(zhuǎn)速150 r/min為條件實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4所示。

    圖4 最適發(fā)酵溫度單因素實(shí)驗(yàn)Fig.4 Single factor experiment of optimum fermentation temperature

    從圖4中發(fā)現(xiàn):溫度為32 ℃時,酒精質(zhì)量濃度最高為20.5 mg/mL,菌株K-6發(fā)酵酒精的最適溫度為32 ℃。

    選擇pH為變量因素,溫度30 ℃、時間3 d和轉(zhuǎn)速150 r/min為條件做實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖5所示。當(dāng)pH為6時,酒精質(zhì)量濃度最高19.8 mg/mL,從而可確定菌株K-6發(fā)酵酒精的最適pH為6。

    圖5 最適發(fā)酵pH單因素實(shí)驗(yàn)Fig.5 Single factor experiment of optimum fermentation pH

    選擇發(fā)酵時間為變量因素,溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min和自然pH做單因素實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖6所示。在5 d時發(fā)酵基本結(jié)束,酒精質(zhì)量濃度最高為23.6 mg/mL,從而可確定菌株K-6發(fā)酵酒精的最適發(fā)酵時間為5 d。

    圖6 最適發(fā)酵時間單因素實(shí)驗(yàn)Fig.6 Single factor experiment of optimum fermentation time

    選擇攪拌轉(zhuǎn)速為實(shí)驗(yàn)變量因素,溫度30 ℃、時間3 d和pH自然條件下開展單因素實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖7所示。在100 r/min時,酒精質(zhì)量濃度最高為18.6 mg/mL,從而可確定菌株K-6發(fā)酵酒精的最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速為100 r/min。

    圖7 最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速單因素實(shí)驗(yàn)Fig.7 Single factor experiment of optimum fermentation mixing speed

    以確定的單因素最適發(fā)酵條件為基礎(chǔ),選定因素的3個水平如表1所示,設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)以確定最優(yōu)發(fā)酵條件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

    表1 因素水平表Table 1 Table of Factors level

    表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of L9(34)

    根據(jù)F檢驗(yàn)4個因素都不是顯著影響因素,所以按照實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定A1B2C3D3為最優(yōu)發(fā)酵條件,即溫度30 ℃,pH 6,轉(zhuǎn)速150 r/min和時間6 d,D因素的極差R最大,即發(fā)酵時間對酒精生成的影響相對比較明顯,最后采用最優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵,酒精質(zhì)量濃度可以達(dá)到29.1 mg/mL。

    3 結(jié) 論

    實(shí)驗(yàn)成功篩選獲得一株菌K-6,證明其能夠直接發(fā)酵殼聚糖生成酒精,經(jīng)ITS分子鑒定,結(jié)合菌落形態(tài),生殖方式,顯色反應(yīng),以及可發(fā)酵產(chǎn)生酒精的特性,確定其屬于S.cerevisiae釀酒酵母菌,并通過實(shí)驗(yàn)確定了其生成酒精的最優(yōu)發(fā)酵條件。以殼聚糖為原料發(fā)酵生成酒精,為幾丁質(zhì)的綜合利用找到了一個可能的新方向,接下來將繼續(xù)研究酵母菌株K-6發(fā)酵產(chǎn)生酒精的酶系構(gòu)成和催化機(jī)制,通過誘變菌株,構(gòu)建工程菌或者采用固定化酶技術(shù)等途徑,以期進(jìn)一步提高酒精發(fā)酵效率和發(fā)酵穩(wěn)定性,并嘗試探索從幾丁質(zhì)降解到發(fā)酵產(chǎn)生酒精的完整工藝過程和條件,為規(guī)?;I(yè)生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支持。

    本文得到了徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項(xiàng)目(2017KY06)的資助。

    猜你喜歡
    幾丁質(zhì)重鉻酸鉀殼聚糖
    氧化還原電位滴定法測量鈾含量的不確定度評定
    產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的無色桿菌ZWW8的發(fā)酵產(chǎn)酶及酶學(xué)性質(zhì)研究
    重鉻酸鉀滴定鐵礦石中全鐵含量測定不確定度評定
    四川冶金(2021年6期)2021-02-15 06:37:18
    微生物幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀
    中國釀造(2017年8期)2017-09-03 06:20:01
    殼聚糖的應(yīng)用
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:46
    水質(zhì)監(jiān)測快速COD分光光度法與重鉻酸鉀法的比較
    電位滴定法測定基準(zhǔn)U3O8中鈾的不確定度評定
    殼聚糖對尿路感染主要病原菌的體外抑制作用
    堿浸處理對殼聚糖膜性質(zhì)的影響
    幾丁質(zhì)酶及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用
    浙江柑橘(2013年2期)2013-01-22 01:34:29
    久久精品国产清高在天天线| 波多野结衣一区麻豆| 日本a在线网址| 夜夜爽天天搞| 18禁国产床啪视频网站| 99国产精品免费福利视频| 欧美日本中文国产一区发布| 国产成人精品无人区| av网站免费在线观看视频| 制服诱惑二区| 成人18禁在线播放| 男男h啪啪无遮挡| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 宅男免费午夜| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美另类亚洲清纯唯美| 制服人妻中文乱码| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产99白浆流出| 欧美性长视频在线观看| 午夜福利,免费看| 777米奇影视久久| 麻豆av在线久日| 黄色女人牲交| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 咕卡用的链子| 日韩有码中文字幕| 久久香蕉国产精品| 精品人妻1区二区| 黄色怎么调成土黄色| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲成人国产一区在线观看| 日韩免费av在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品免费视频内射| 国产亚洲精品一区二区www | 久久香蕉国产精品| 亚洲全国av大片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 99香蕉大伊视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| a级片在线免费高清观看视频| ponron亚洲| 超碰97精品在线观看| 亚洲三区欧美一区| 精品高清国产在线一区| 久久国产精品影院| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产av一区二区精品久久| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲专区中文字幕在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美一级毛片孕妇| 日韩成人在线观看一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 后天国语完整版免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲av成人av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 免费看a级黄色片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 在线国产一区二区在线| 欧美最黄视频在线播放免费 | 国产野战对白在线观看| 久久亚洲精品不卡| 欧美日韩av久久| 乱人伦中国视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久精品91无色码中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 不卡av一区二区三区| 成人影院久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 成人影院久久| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美一级毛片孕妇| av福利片在线| 最新的欧美精品一区二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲精品在线观看二区| a级毛片黄视频| 极品人妻少妇av视频| 男女下面插进去视频免费观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 一级片免费观看大全| bbb黄色大片| 欧美国产精品一级二级三级| 成年人午夜在线观看视频| 国产在线一区二区三区精| 国产精品免费一区二区三区在线 | 叶爱在线成人免费视频播放| 操美女的视频在线观看| 亚洲专区字幕在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 咕卡用的链子| 亚洲色图av天堂| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲熟女毛片儿| 精品人妻在线不人妻| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产成人免费观看mmmm| 午夜福利影视在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 丝瓜视频免费看黄片| 中亚洲国语对白在线视频| 午夜福利影视在线免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲avbb在线观看| 日本a在线网址| 男女床上黄色一级片免费看| 久久狼人影院| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产精华一区二区三区| 亚洲五月天丁香| 午夜精品在线福利| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品久久视频播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 性色av乱码一区二区三区2| 一区二区三区精品91| 久9热在线精品视频| 视频区图区小说| 十八禁人妻一区二区| av片东京热男人的天堂| 午夜成年电影在线免费观看| 久久ye,这里只有精品| 中文字幕最新亚洲高清| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产精品一区二区在线不卡| 色综合欧美亚洲国产小说| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 手机成人av网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 老汉色∧v一级毛片| 在线视频色国产色| 免费看a级黄色片| 搡老岳熟女国产| 在线观看一区二区三区激情| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品国产亚洲在线| 亚洲国产欧美网| 日本五十路高清| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 十八禁人妻一区二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜视频精品福利| 1024香蕉在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本黄色视频三级网站网址 | 久久精品成人免费网站| 国产午夜精品久久久久久| 宅男免费午夜| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美在线一区亚洲| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲专区中文字幕在线| 啦啦啦 在线观看视频| 最新的欧美精品一区二区| 色综合欧美亚洲国产小说| 岛国在线观看网站| 国产淫语在线视频| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 极品人妻少妇av视频| 午夜日韩欧美国产| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 老司机靠b影院| 日韩三级视频一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 久久ye,这里只有精品| 亚洲中文字幕日韩| 成年动漫av网址| 精品国产乱码久久久久久男人| 成人国语在线视频| 午夜福利影视在线免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 日韩大码丰满熟妇| 黑人欧美特级aaaaaa片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产亚洲欧美在线一区二区| 后天国语完整版免费观看| 国精品久久久久久国模美| 好男人电影高清在线观看| 成在线人永久免费视频| 高清av免费在线| 国产精品1区2区在线观看. | 中文欧美无线码| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美日韩精品网址| 午夜福利,免费看| 国产av又大| 在线播放国产精品三级| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 91国产中文字幕| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 最新的欧美精品一区二区| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品久久视频播放| 免费在线观看亚洲国产| av一本久久久久| 少妇 在线观看| 国产精品二区激情视频| 久久这里只有精品19| 高清欧美精品videossex| 丁香欧美五月| 国产精品久久视频播放| 一级毛片高清免费大全| 国产xxxxx性猛交| 高清黄色对白视频在线免费看| 777米奇影视久久| 午夜激情av网站| 18禁国产床啪视频网站| 热99re8久久精品国产| 在线国产一区二区在线| 一a级毛片在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 另类亚洲欧美激情| 久久香蕉激情| 不卡av一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 激情在线观看视频在线高清 | 在线观看日韩欧美| 午夜91福利影院| 搡老岳熟女国产| 最近最新免费中文字幕在线| xxxhd国产人妻xxx| 999久久久国产精品视频| 极品教师在线免费播放| 大片电影免费在线观看免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 精品久久久久久电影网| 欧美激情久久久久久爽电影 | 99久久综合精品五月天人人| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 18禁观看日本| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲熟女毛片儿| av有码第一页| 亚洲精品乱久久久久久| 少妇 在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 黄色丝袜av网址大全| 91在线观看av| 不卡av一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美激情在线| 免费看a级黄色片| 精品电影一区二区在线| 精品国产美女av久久久久小说| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美日韩成人在线一区二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 乱人伦中国视频| 波多野结衣一区麻豆| netflix在线观看网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 日本wwww免费看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 美国免费a级毛片| 欧美黑人精品巨大| 99久久精品国产亚洲精品| a级毛片黄视频| 午夜免费观看网址| 欧美一级毛片孕妇| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产一区有黄有色的免费视频| 丝袜人妻中文字幕| 国产1区2区3区精品| 欧美在线黄色| tocl精华| 成人永久免费在线观看视频| 丰满的人妻完整版| 免费在线观看亚洲国产| 久热爱精品视频在线9| 国产欧美亚洲国产| 国产精品久久电影中文字幕 | 久久狼人影院| 日本wwww免费看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产激情久久老熟女| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 99国产精品99久久久久| 精品国产美女av久久久久小说| 无人区码免费观看不卡| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲av熟女| 日日夜夜操网爽| 美女视频免费永久观看网站| www.999成人在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 麻豆成人av在线观看| 精品人妻在线不人妻| 欧美日韩福利视频一区二区| 9热在线视频观看99| 美女高潮到喷水免费观看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久久久精品吃奶| 黑人操中国人逼视频| 久久精品国产清高在天天线| 91麻豆av在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 男人的好看免费观看在线视频 | 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产精品 欧美亚洲| 黄片播放在线免费| 成年动漫av网址| 国产91精品成人一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 女警被强在线播放| 成年人午夜在线观看视频| www.999成人在线观看| 久久99一区二区三区| 国产高清videossex| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 99精品久久久久人妻精品| 中文字幕最新亚洲高清| 在线观看一区二区三区激情| 国产国语露脸激情在线看| 女同久久另类99精品国产91| 露出奶头的视频| 国产精品 欧美亚洲| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久精品91无色码中文字幕| 美国免费a级毛片| 亚洲视频免费观看视频| 中出人妻视频一区二区| 身体一侧抽搐| 男女免费视频国产| 一级毛片女人18水好多| 欧美午夜高清在线| 狂野欧美激情性xxxx| 热re99久久精品国产66热6| 国产有黄有色有爽视频| 一级毛片高清免费大全| 人妻一区二区av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美日韩黄片免| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 捣出白浆h1v1| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日本欧美视频一区| 热99re8久久精品国产| 午夜两性在线视频| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美日韩精品网址| 91av网站免费观看| 久久 成人 亚洲| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91麻豆av在线| 精品久久久久久,| 久9热在线精品视频| 激情在线观看视频在线高清 | 后天国语完整版免费观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 男女下面插进去视频免费观看| 在线观看舔阴道视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一二三四社区在线视频社区8| 我的亚洲天堂| 久久香蕉国产精品| 亚洲成人手机| 天堂中文最新版在线下载| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲视频免费观看视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 麻豆成人av在线观看| 国产有黄有色有爽视频| xxxhd国产人妻xxx| 精品人妻在线不人妻| 亚洲免费av在线视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 午夜福利,免费看| 欧美日韩一级在线毛片| 99久久99久久久精品蜜桃| 天天影视国产精品| 一级,二级,三级黄色视频| 99re在线观看精品视频| а√天堂www在线а√下载 | 热99国产精品久久久久久7| 一级a爱片免费观看的视频| 女人久久www免费人成看片| 一级片'在线观看视频| 男女午夜视频在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 午夜两性在线视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 老司机亚洲免费影院| 叶爱在线成人免费视频播放| 中文字幕高清在线视频| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美丝袜亚洲另类 | 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 午夜精品国产一区二区电影| 香蕉国产在线看| 九色亚洲精品在线播放| 久久精品国产亚洲av高清一级| 在线国产一区二区在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲第一青青草原| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 成熟少妇高潮喷水视频| 岛国在线观看网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美色视频一区免费| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美在线黄色| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久久国内视频| 亚洲av片天天在线观看| 国产淫语在线视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲国产精品sss在线观看 | 久久久久久久久久久久大奶| 婷婷丁香在线五月| 国产精品免费视频内射| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 大码成人一级视频| 亚洲欧美激情在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品高清国产在线一区| 国产真人三级小视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产在视频线精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 大香蕉久久成人网| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 又紧又爽又黄一区二区| 国产三级黄色录像| aaaaa片日本免费| av免费在线观看网站| 91成人精品电影| 18禁美女被吸乳视频| 精品久久久久久电影网| a级毛片黄视频| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精品 国内视频| 黄色怎么调成土黄色| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 大片电影免费在线观看免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲中文av在线| 99精品在免费线老司机午夜| 十八禁网站免费在线| xxxhd国产人妻xxx| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一级毛片精品| 久久香蕉国产精品| 精品高清国产在线一区| 亚洲人成77777在线视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 成在线人永久免费视频| 一本大道久久a久久精品| 18禁美女被吸乳视频| 久久久久久久久免费视频了| 男女床上黄色一级片免费看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 一二三四社区在线视频社区8| 国产成人av激情在线播放| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲av成人一区二区三| 69av精品久久久久久| 身体一侧抽搐| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 免费av中文字幕在线| 五月开心婷婷网| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲国产精品sss在线观看 | 日本欧美视频一区| 久久午夜亚洲精品久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 超色免费av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲黑人精品在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产成人精品久久二区二区91| 一本综合久久免费| 满18在线观看网站| 少妇 在线观看| 久久性视频一级片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品一区二区三区四区五区乱码| 无遮挡黄片免费观看| 在线av久久热| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品国产美女av久久久久小说| 成人18禁在线播放| 99精品欧美一区二区三区四区| 一级毛片精品| 国产成人精品在线电影| 成人永久免费在线观看视频| 中亚洲国语对白在线视频| 久久久久久久国产电影| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产在视频线精品| 高清黄色对白视频在线免费看| 老司机在亚洲福利影院| 最近最新免费中文字幕在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 中文欧美无线码| 亚洲三区欧美一区| 精品熟女少妇八av免费久了| 嫩草影视91久久| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产区一区二久久| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产亚洲精品一区二区www | 超碰97精品在线观看| 777米奇影视久久| 国产精品九九99| 午夜激情av网站| 亚洲欧美激情综合另类| 99热只有精品国产| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 另类亚洲欧美激情| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 波多野结衣一区麻豆| av欧美777| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| tube8黄色片| 日日夜夜操网爽| 1024视频免费在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 91字幕亚洲| 最新美女视频免费是黄的| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲专区中文字幕在线| 搡老乐熟女国产| 51午夜福利影视在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 老汉色∧v一级毛片| 多毛熟女@视频| 香蕉丝袜av| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 男人舔女人的私密视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲一码二码三码区别大吗| 乱人伦中国视频| 我的亚洲天堂| a级毛片在线看网站| 村上凉子中文字幕在线| 一级毛片精品| 欧美日韩成人在线一区二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| 后天国语完整版免费观看| 国产免费av片在线观看野外av|