工業(yè)微生物乙酸響應(yīng)與調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

程國平,陳 琛,李必金,李 巖

(廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北 廊坊 065001)

乙酸是一種酸性較弱的有機(jī)酸,具有一定的毒性作用,在較低質(zhì)量濃度下即可抑制微生物的生長和代謝[1],乙酸所具有的這種抑菌性作用使其可用作防腐劑,廣泛用于食品行業(yè)。乙酸對(duì)微生物產(chǎn)生毒性作用的原因主要是其在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生解離,降低胞內(nèi)pH值,使胞內(nèi)環(huán)境酸化,嚴(yán)重影響微生物的物質(zhì)合成、金屬轉(zhuǎn)運(yùn)和能量傳遞等過程,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損[2],這制約了以微生物發(fā)酵技術(shù)為基礎(chǔ)的工業(yè)生產(chǎn)過程。從這個(gè)角度上講,提高工業(yè)微生物對(duì)乙酸的耐受性對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)過程具有重要意義。

微生物在乙酸脅迫下具有相應(yīng)的響應(yīng)與調(diào)控機(jī)制,從而盡可能減少乙酸帶來的負(fù)面影響,因此需要理解乙酸對(duì)工業(yè)微生物的主要影響以及微生物響應(yīng)乙酸脅迫的相關(guān)機(jī)制。鑒于此,筆者選取了3種廣泛應(yīng)用于發(fā)酵領(lǐng)域的工業(yè)微生物,包括釀酒酵母、大腸桿菌及谷氨酸棒狀桿菌,并在其乙酸響應(yīng)機(jī)制方面進(jìn)行了細(xì)致討論。目前,這3種工業(yè)微生物已經(jīng)有許多關(guān)于乙酸毒性作用及微生物在乙酸壓力下響應(yīng)與調(diào)控反應(yīng)的研究[3-4],這些信息能夠增加對(duì)乙酸耐受性的了解,并且有助于開發(fā)耐乙酸的工業(yè)菌株。筆者對(duì)這3種工業(yè)微生物的乙酸響應(yīng)和耐受機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)性綜述,重點(diǎn)從乙酸對(duì)微生物的毒害作用及微生物應(yīng)對(duì)乙酸脅迫時(shí)所作出的有效調(diào)控這兩方面進(jìn)行闡述,列舉了近些年國內(nèi)外學(xué)者的最新理論與突破性進(jìn)展,這將為克服乙酸干擾的工業(yè)生產(chǎn)過程提供重要的借鑒意義。

1 乙酸毒性機(jī)理

1.1 乙酸積累

木質(zhì)纖維素原料價(jià)格低廉、來源廣泛且成分豐富,其經(jīng)過預(yù)處理后形成的水解液中含有大量的可溶性糖類物質(zhì),因此廣泛用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。然而,在木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中,由于原料自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及降解程度的不可控性,會(huì)不可避免地產(chǎn)生各種抑制微生物生長的化合物[5],這些化合物會(huì)通過抑制微生物的生長和物質(zhì)代謝來影響生物發(fā)酵過程[6]。在這些抑制劑中,乙酸所占的質(zhì)量比最高,有關(guān)研究表明:水解液中乙酸質(zhì)量濃度大約為1～10 g/L[7],因此提高微生物對(duì)乙酸的耐受性是微生物高效利用木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的必要條件。同時(shí),在工業(yè)生產(chǎn)中乙酸也作為副產(chǎn)物或溢流代謝產(chǎn)物而產(chǎn)生,例如釀造及食品工業(yè)中釀酒酵母在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生乙酸,氨基酸和核苷酸發(fā)酵生產(chǎn)中大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌在培養(yǎng)過程中也會(huì)積累乙酸,乙酸代謝生成途徑為

其中:PEP為Phosphoenolpyruvate(磷酸烯醇式丙酮酸);Pyr為Pyruvate(丙酮酸);AcCoA為Acetyl-CoA(乙酰輔酶A);POXB為Pyruvate oxidase(丙酮酸氧化酶);CTF為CoA-transferase(輔酶A轉(zhuǎn)移酶);PTA為Phosphotransacetylase(磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶);ACK為Acetate kinase(乙酸激酶)。

通常情況下,乙酸的產(chǎn)生一方面是由于需氧型微生物在面臨氧氣缺乏時(shí)以乙酰輔酶A為底物,產(chǎn)生乙酸和ATP,ATP供細(xì)胞使用來滿足自身能量需求[8];另一方面即使氧氣供應(yīng)充足,也有可能會(huì)積累乙酸,這是因?yàn)樵谟醒鯒l件下,NADH除了通過呼吸鏈將電子傳遞給氧而重新氧化外,還通過發(fā)酵途徑來氧化,造成某種產(chǎn)物積累的過程,如乳酸發(fā)酵或酒精發(fā)酵,即當(dāng)微生物呼吸受限,葡萄糖吸收速率高于呼吸鏈對(duì)NADH的氧化速率,過剩的還原力會(huì)導(dǎo)致乙酸的溢流[9],從而影響工業(yè)微生物的生物量積累及代謝活性,降低目標(biāo)生物產(chǎn)品的最終產(chǎn)量。

1.2 乙酸擴(kuò)散及胞內(nèi)解離

乙酸的酸離解常數(shù)pKa值為4.75。根據(jù)Henderson-Hasselbalch方程[10],pKa與溶液pH值及乙酸質(zhì)子化和離子形式的量有關(guān)。當(dāng)溶液pH值等于pKa值時(shí),約50%的乙酸處于未解離形式(CH3COOH)。當(dāng)溶液pH低于4.75時(shí),大多數(shù)乙酸以其分子形成存在,如pH為3.75時(shí),約90%的乙酸被質(zhì)子化,而pH為2.75時(shí),約99%的乙酸被質(zhì)子化。由于未解離的乙酸分子具有親脂性特點(diǎn),很容易通過擴(kuò)散作用而透過細(xì)胞質(zhì)膜,已有的研究表明在釀酒酵母中乙酸也可以通過由水甘油通道蛋白Fps1p介導(dǎo)的促進(jìn)擴(kuò)散作用而進(jìn)入胞內(nèi)[11]。之后乙酸分子在細(xì)胞質(zhì)中解離,氫離子(H+)與醋酸根(CH3COO-)被釋放,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部酸化。因此乙酸主要是以未解離形式對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響,這與強(qiáng)酸(如HCl)產(chǎn)生的影響明顯不同,強(qiáng)酸在培養(yǎng)基中以離子形式存在,盡管能夠使培養(yǎng)基酸化而改變細(xì)胞生長的外環(huán)境,但因?yàn)殡x子擴(kuò)散能力較差,無法穿過細(xì)胞質(zhì)膜,細(xì)胞質(zhì)無法被酸化,所以單純降低培養(yǎng)基的pH值所產(chǎn)生的抑制遠(yuǎn)低于有機(jī)弱酸在胞內(nèi)進(jìn)行酸化而產(chǎn)生的抑制。

1.3 乙酸對(duì)細(xì)胞的毒性機(jī)制

乙酸的毒性作用嚴(yán)重影響微生物生長與物質(zhì)代謝過程。Casey等[12]研究顯示乙酸能夠抑制釀酒酵母對(duì)葡萄糖與木糖的利用,因此生長受限;Contiero等[13]研究了當(dāng)乙酸質(zhì)量濃度超過1 g/L時(shí),即會(huì)抑制大腸桿菌生物量的積累,進(jìn)而影響重組蛋白的生產(chǎn)。對(duì)于谷氨酸棒狀桿菌,盡管能夠以乙酸作為碳源進(jìn)行代謝,但是較低質(zhì)量濃度的乙酸仍會(huì)抑制谷氨酸棒狀桿菌的生長[14]。乙酸對(duì)細(xì)胞的毒性機(jī)制主要體現(xiàn)在3個(gè)方面:

1) 乙酸分子進(jìn)入細(xì)胞使胞內(nèi)環(huán)境酸化,會(huì)影響蛋白質(zhì)合成與氨基酸代謝。Li等[15]研究了乙酸影響釀酒酵母中與組氨酸、精氨酸和色氨酸合成有關(guān)的酶系,因此胞內(nèi)氨基酸代謝出現(xiàn)異常;Ding等[16]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母培養(yǎng)基中添加含有乙酸的抑制劑后,與蛋白質(zhì)降解有關(guān)的基因表達(dá)上調(diào),通過分析推測(cè)出含有乙酸的抑制劑會(huì)造成釀酒酵母的胞內(nèi)蛋白變性,從而影響細(xì)胞的正常生理功能;Han等[17]研究了當(dāng)大腸桿菌受到乙酸的脅迫時(shí),通過補(bǔ)加甲硫氨酸可以減弱由乙酸引起的抑制效果,但相關(guān)機(jī)制并不清晰,直到2008年,Mordukhova等[18]表明乙酸可能會(huì)抑制甲硫氨酸生物合成的相關(guān)酶,不僅阻止了甲硫氨酸的生物合成,而且導(dǎo)致有毒中間產(chǎn)物高半胱氨酸的積累,因此嚴(yán)重影響了大腸桿菌正常生長及胞內(nèi)物質(zhì)代謝過程。

2) 乙酸對(duì)微生物的能量代謝會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響,使微生物所需的能量減少,因此生長受到抑制。Pearce等[19]表明釀酒酵母胞內(nèi)的酸化環(huán)境不利于糖酵解途徑的進(jìn)行,因此減弱了細(xì)胞產(chǎn)生ATP的能力;Ding等[16]研究了在乙酸影響下,釀酒酵母中與能量產(chǎn)生有關(guān)的酶表達(dá)下調(diào),因此細(xì)胞出現(xiàn)了生長停滯現(xiàn)象。另外,乙酸在胞內(nèi)解離后,細(xì)胞為抵消內(nèi)部酸化及陰離子積累會(huì)作出相應(yīng)的抗脅迫反應(yīng),即通過質(zhì)子泵與相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分別將H+與CH3COO-泵出胞外,但這需要ATP的水解,因此消耗了大量能量。然而,被泵出胞外的H+與CH3COO-在外界較低的pH下會(huì)重新結(jié)合為乙酸分子,并可能通過擴(kuò)散作用再次進(jìn)入胞內(nèi)并發(fā)生解離,這就形成了ATP不斷消耗的無用循環(huán),導(dǎo)致細(xì)胞所需的能量供應(yīng)減少,從而抑制了細(xì)胞生長和代謝。

3) 乙酸在其他方面也會(huì)影響微生物生長及代謝。Wolfe[20]表明在大腸桿菌中,乙酸在胞內(nèi)解離后陰離子的積累增加了細(xì)胞內(nèi)部滲透壓,不利于代謝反應(yīng)的進(jìn)行。乙酸會(huì)誘導(dǎo)釀酒酵母內(nèi)部氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物(ROS),導(dǎo)致細(xì)胞受到損傷[21]。Ding等[22]研究了在乙酸脅迫下釀酒酵母攝取培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的能力下降,這并不利于細(xì)胞生長。

2 乙酸耐受機(jī)制

微生物已進(jìn)化出不同的機(jī)制來應(yīng)對(duì)乙酸帶來的脅迫作用。耐乙酸機(jī)制大致分為:通過對(duì)乙酸進(jìn)行分解代謝降低其質(zhì)量濃度,阻止乙酸進(jìn)入胞內(nèi),將胞內(nèi)的氫離子及醋酸根陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。

2.1 乙酸代謝

微生物能夠以乙酸作為碳源進(jìn)行物質(zhì)代謝,因此可有效地降低培養(yǎng)基中乙酸的質(zhì)量濃度。不同微生物對(duì)乙酸的分解代謝具有一定差異:在葡萄糖存在下,釀酒酵母中與乙酸分解代謝相關(guān)的酶被強(qiáng)烈抑制,因此釀酒酵母難以代謝乙酸[23],只能通過其他機(jī)制來減弱乙酸引起的毒害作用,這種情況與大腸桿菌K-12類似。然而,并非所有大腸桿菌都具有這種嚴(yán)格的分解代謝產(chǎn)物阻遏機(jī)制,例如大腸桿菌BL21會(huì)同時(shí)消耗葡萄糖和乙酸,乙酸在乙酸激酶ACK和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶PTA的催化作用下形成乙酰輔酶A,之后進(jìn)入三羧酸循環(huán)中進(jìn)行代謝[24],從而通過降低乙酸質(zhì)量濃度來減弱其毒性作用[25]。大腸桿菌代謝乙酸的過程中通過乙醛酸途徑的碳通量較小,導(dǎo)致細(xì)胞生長較慢,當(dāng)乙酸被消耗完全時(shí),細(xì)胞則以葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行代謝并迅速恢復(fù)生長[26]。

谷氨酸棒狀桿菌在發(fā)酵工業(yè)中主要用于氨基酸的生產(chǎn),如谷氨酸與賴氨酸[27]。乙酸能夠?qū)劝彼岚魻顥U菌產(chǎn)生一定毒性,雖然目前對(duì)乙酸抑制谷氨酸棒狀桿菌的機(jī)制研究較少,但其毒性機(jī)理可能與大腸桿菌類似。谷氨酸棒狀桿菌可同時(shí)利用培養(yǎng)基中的多種碳源物質(zhì)[28],因此在面對(duì)乙酸脅迫時(shí),最主要的響應(yīng)機(jī)制為分解代謝。Wendisch等[29比較了谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032以葡萄糖、乙酸為唯一碳源及以兩者混合物為碳源時(shí)的生長情況,發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌雖然能夠代謝乙酸,但比生長速率及生物量積累明顯小于以葡萄糖作為唯一碳源時(shí)的情況,因此生長受到一定抑制。為了更深入的闡明問題,研究人員測(cè)定了谷氨酸棒狀桿菌利用不同碳源時(shí)的代謝通量,并進(jìn)行了核心碳代謝流分析(圖1),與以葡萄糖為唯一碳源時(shí)相比,以乙酸為唯一碳源及以葡萄糖和乙酸為混合碳源生長時(shí)碳代謝流顯示出完全不同的通量分布:乙酸的存在導(dǎo)致了較為明顯的乙醛酸途徑通量,并且在CO2固定途徑中表現(xiàn)出了可逆的糖異生凈通量,可提供糖酵解途徑及磷酸戊糖途徑中的前體物質(zhì)。同時(shí),磷酸烯醇式丙酮酸與丙酮酸的形成大幅度減少,丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的活性也明顯降低甚至喪失,這直接導(dǎo)致由葡萄糖氧化成乙酰輔酶A的碳的比例大大降低。TCA循環(huán)中的酶活性盡管顯示出增加的趨勢(shì),但由于不同底物攝取時(shí)絕對(duì)通量具有較大差異性,因此TCA循環(huán)的絕對(duì)通量減小?？傊?當(dāng)谷氨酸棒狀桿菌面對(duì)乙酸脅迫時(shí),雖然會(huì)代謝乙酸而減弱其毒性作用,但是碳通量分布的變化會(huì)影響菌株的生長及物質(zhì)代謝,從而對(duì)發(fā)酵過程造成一定的負(fù)面影響。

G6P—Glucose-6-phosphate(葡萄糖-6-磷酸);F6P—Fructose-6-phosphate(果糖-6-磷酸);G3P—Glyceraldehyde-3-phosphate(甘油醛-3-磷酸);P5P—Pentose-5-phosphates(戊糖-5-磷酸);E4P—Erythrose-4-phosphate(赤蘚糖-4-磷酸);S7P—Sedoheptu-lose-7-phosphate(景天庚酮糖-7-磷酸);ICI—Isocitrate(異檸檬酸);αKG—2-oxoglutarate(2-酮戊二酸);SUC—Succinate(琥珀酸);MAL—Malate(蘋果酸);OAA—Oxaloacetate(草酰乙酸)。圖1 不同碳源時(shí)的代謝流通量分布Fig.1 Metabolic flux distributions of different carbon sources

2.2 乙酸擴(kuò)散減小

限制乙酸通過擴(kuò)散作用進(jìn)入胞內(nèi)是微生物響應(yīng)及耐受乙酸的重要機(jī)制,主要包括改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),降低孔隙率來減小乙酸的擴(kuò)散速率、改變細(xì)胞膜組分來減少乙酸分子的吸收以及其他方面的機(jī)制來減少乙酸向胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散。Simoes等[30]報(bào)道釀酒酵母在乙酸脅迫下,與細(xì)胞壁功能有關(guān)的蛋白被表達(dá),結(jié)果為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,表現(xiàn)出多孔結(jié)構(gòu)的減少,因此能夠有效阻止乙酸進(jìn)入細(xì)胞。同時(shí),在乙酸脅迫下,膜組分中脂肪酸含量發(fā)生變化,如大腸桿菌O157∶H7隨著培養(yǎng)基中pH降低,細(xì)胞質(zhì)膜中棕櫚酸含量顯著增加,環(huán)脂肪酸含量降低[31],在大腸桿菌K-12中,乙酸質(zhì)量濃度的增加會(huì)導(dǎo)致脂肪酸比例發(fā)生改變,如C16∶1脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)镃18∶1脂肪酸[32],這些變化有助于調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性,保護(hù)膜脂質(zhì)免受乙酸誘導(dǎo)的氧自由基損傷,也能在一定程度上阻止乙酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。此外,在釀酒酵母細(xì)胞膜中含有與乙酸轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白Fps1p,乙酸脅迫下Fps1p蛋白被磷酸化并發(fā)生內(nèi)吞作用,因此減少了乙酸通過該蛋白而擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,從而降低了乙酸對(duì)細(xì)胞的毒害,這是微生物阻止乙酸向胞內(nèi)擴(kuò)散的另外一種機(jī)制[33]。

2.3 胞內(nèi)酸化程度減弱

由于乙酸抑制微生物生長的主要原因是細(xì)胞內(nèi)部酸化,因此微生物更為直接的響應(yīng)機(jī)制是減弱胞內(nèi)酸化程度,即將胞內(nèi)的氫離子(H+)泵出胞外,從而減少細(xì)胞所受到的毒害作用。在乙酸存在情況下,釀酒酵母會(huì)上調(diào)細(xì)胞質(zhì)膜中質(zhì)子泵PM-H+-ATPase與液泡膜中質(zhì)子泵V-ATPase的活性,質(zhì)子泵能夠在ATP水解作用下將氫離子泵出胞外或液泡腔中,從而減弱胞內(nèi)酸化程度并使內(nèi)部pH值維持在正常范圍內(nèi)[34-35]。大腸桿菌抵抗細(xì)胞內(nèi)部酸化涉及多種機(jī)制,這里主要介紹其中的兩種,一種機(jī)制為消除有危害的質(zhì)子來增加胞內(nèi)的pH,通過K+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用使質(zhì)子交換鉀離子或通過氨基酸脫羧作用來實(shí)現(xiàn),如在乙酸脅迫下,大腸桿菌中谷氨酸脫羧酶GadA催化谷氨酸脫羧形成γ-氨基丁酸,該脫羧反應(yīng)不僅消耗了胞內(nèi)氫離子,也能夠消耗谷氨酸陰離子,從而一定程度上減少乙酸脅迫下細(xì)胞膜電位的消散[36]。同理,賴氨酸與精氨酸的脫羧系統(tǒng)也與乙酸耐受性有關(guān);2013年,Lu等[37]報(bào)道了另一種耐受有機(jī)弱酸的機(jī)制,在酸脅迫下,大腸桿菌能夠通過該機(jī)制來調(diào)控胞內(nèi)pH值,大致過程為將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸,同時(shí)釋放氣態(tài)氨,從而中和氫離子。

2.4 醋酸根離子外運(yùn)系統(tǒng)誘導(dǎo)

乙酸在胞內(nèi)解離后釋放氫離子的同時(shí),也導(dǎo)致了醋酸根陰離子的積累。胞內(nèi)醋酸根離子的大量存在增加了膜電位,不利于物質(zhì)傳遞,因此會(huì)影響細(xì)胞正常生理功能[38]。因?yàn)榇姿岣x子所帶的電荷屬性使其無法通過擴(kuò)散作用而穿過細(xì)胞質(zhì)膜,所以激活乙酸分解代謝是減少胞內(nèi)醋酸根質(zhì)量濃度的有效途徑。研究人員發(fā)現(xiàn):當(dāng)醋酸根離子積累于胞內(nèi)時(shí),細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將胞內(nèi)的醋酸根轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外,從而在一定程度上減小細(xì)胞內(nèi)醋酸根離子所引起的不利影響。Nakano等[39]在大腸桿菌和醋酸菌中發(fā)現(xiàn)了分子量為60 kDa的膜蛋白,該蛋白被推斷為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可將胞內(nèi)醋酸根離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外,當(dāng)研究人員通過表達(dá)該蛋白后發(fā)現(xiàn)醋酸菌能夠在含有更高質(zhì)量濃度乙酸的培養(yǎng)基中生長且其比生長速率有所增大。對(duì)于釀酒酵母,由于葡萄糖存在時(shí)乙酸的分解代謝過程被強(qiáng)烈抑制,因此細(xì)胞減少內(nèi)部醋酸根離子積累的唯一途徑為相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)醋酸根至胞外,如在乙酸響應(yīng)下,多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MDR能夠?qū)麅?nèi)的醋酸根泵出胞外,從而有利于提高釀酒酵母對(duì)乙酸的耐受性[40]。

3 結(jié) 論

微生物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)已經(jīng)成為發(fā)酵工業(yè)的重要研究方向。在工業(yè)發(fā)酵過程中,乙酸是關(guān)鍵的制約因素,會(huì)嚴(yán)重影響微生物的生物量積累與目標(biāo)生物產(chǎn)物合成。系統(tǒng)地研究乙酸毒性機(jī)理,并理解不同微生物體系下的乙酸耐受機(jī)制,對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)菌株的構(gòu)建和選育具有重要意義。隨著微生物組學(xué)研究的深入發(fā)展,將從分子水平上進(jìn)一步揭示微生物耐受乙酸的分子機(jī)制,并通過代謝工程與合成生物學(xué)策略,設(shè)計(jì)適合工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良菌株,從而打破乙酸所導(dǎo)致的生產(chǎn)瓶頸。