酶法制備不飽和果膠低聚糖及其抑菌活性研究

俞 敏,謝王玲,夏元丹,章銀軍

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

果膠低聚糖(POS)是一種新型功能性糖源,通常由2～20個(gè)半乳糖醛酸通過(guò)α-1,4-糖苷鍵連接而成[1],部分半乳糖醛酸也以甲酯形式存在[2]。研究表明:其具有良好的生理活性,例如抑制尿路致病微生物生長(zhǎng)[3],促進(jìn)人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞凋亡[4],抗肥胖、抗毒性、抗感染、抗菌和抗氧化作用[5]。POS可以通過(guò)酸水解、氧化法和化學(xué)合成法等化學(xué)法制備得到[6],也可以通過(guò)酶作用于特定原料制備得到[7]。相比于化學(xué)法,酶降解法具有選擇性好、副反應(yīng)少和操作方便等優(yōu)勢(shì)[8]。果膠裂解酶(PL)作為果膠解聚酶的一種,可通過(guò)催化果膠半乳糖醛酸殘基的C-4和C-5發(fā)生氫的反式消去反應(yīng)來(lái)完成糖苷鍵裂解,產(chǎn)生不飽和果膠低聚糖(UPO),其富含的不飽和雙鍵對(duì)低聚糖產(chǎn)物的生物活性具有顯著影響[9]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)果膠低聚糖的研究主要體現(xiàn)在植物體促生長(zhǎng)誘導(dǎo)活性和動(dòng)物體促雙歧桿菌增殖、減毒抗癌方面[10],對(duì)于其抑菌活性的研究很少,但已有研究表明POS對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌具有明顯的抑菌效果[11-12]。因此,研究POS的抑菌性及其與一般市售防腐劑的復(fù)配有利于開(kāi)發(fā)新的抑菌防腐劑,為食品防腐提供有價(jià)值的天然抑菌防腐劑。

桔皮果渣是一種常見(jiàn)的農(nóng)廢資源,其果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然高達(dá)20%[13],但因其含水率和酸度較高,極易造成微生物迅速繁殖,如不及時(shí)處理,不僅容易造成嚴(yán)重的環(huán)境污染,也會(huì)產(chǎn)生大量的資源浪費(fèi)[14-15]。本研究通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化PL酶解桔皮果渣提取UPO工藝,并對(duì)UPO進(jìn)行單一和復(fù)配抑菌活性研究,實(shí)現(xiàn)桔皮果渣的高效增值和可持續(xù)發(fā)展,也為天然抑菌防腐劑的開(kāi)辟提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

細(xì)菌培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基):牛肉膏3 g;蛋白胨10 g;氯化鈉5 g;瓊脂15～20 g;水1 000 mL;pH 7.0～7.2;121 ℃下滅菌20 min。

1.1.2 其他材料與試劑

桔皮,衢州果膠有限公司;果膠裂解酶酶液(酶活4 000 U/mL;酶活單位定義(U):在40 ℃,pH 6.8條件下,每分鐘水解1%果膠,使235 nm處吸光值增加0.01的酶量定義為1個(gè)果膠裂解酶酶活單位,酶活力單位由U/mL表示),本實(shí)驗(yàn)室自備;活性干酵母,安琪酵母股份有限公司;DNS試劑[16]:稱取182 g酒石酸鉀鈉,加蒸餾水定容至500 mL,加熱溶解后于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3 g,氫氧化鈉21.0 g,苯酚5.0 g,無(wú)水亞硫酸鈉5.0 g,加熱攪拌至全部溶解,加水稀釋至1 000 mL,儲(chǔ)于棕色瓶中,7～10 d后使用;所有試劑均為分析純,上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度儀,日本島津公司;ZHWY-2112B型恒溫?fù)u床,上海智城分析儀器制造有限公司;10/5/3/1 kDa超濾膜,美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不飽和果膠低聚糖(UPO)的酶法提取及質(zhì)量濃度測(cè)定

將新鮮桔皮于沸水中煮沸10 min滅原酶活,過(guò)濾烘干,用高速粉碎機(jī)粉碎成粉末后過(guò)50目篩備用。取10 g干桔皮粉末加入水100 mL,用4 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為1.2,水浴恒溫85 ℃條件下加熱1 h后用兩層紗布過(guò)濾溶液,調(diào)節(jié)溶液(果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)pH后加入果膠裂解酶液,于搖床中反應(yīng)一段時(shí)間后離心過(guò)濾得到桔皮果渣酶解粗提液。采用DNS法[17]測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度,利用紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定235 nm下的吸光值。還原糖得率計(jì)算公式為

式中:C1為果渣中果膠質(zhì)量濃度,μg/mL;C2為酶解液中還原糖質(zhì)量濃度,μg/mL;V1為酶解前液體體積,mL;V2為酶解后液體體積,mL。

1.3.2 酶法提取UPO條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn):以酶解液中還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn),分別研究pH(3.2,4.2,5.2,6.2,7.2)、酶解溫度(30,40,45,50,60 ℃)、反應(yīng)時(shí)間(1,3,5,7,9 h)和酶添加量(添加量20,40,80,120,160 U/mL)對(duì)酶解液中還原糖質(zhì)量濃度的影響。

正交試驗(yàn):選取影響還原糖質(zhì)量濃度的4個(gè)因素(pH、酶添加量、酶解溫度、反應(yīng)時(shí)間),以酶解液中還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn),其結(jié)果如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.3.3 UPO的分離純化

在酶解液中添加2%的活化安琪酵母,于30 ℃下發(fā)酵反應(yīng)24 h,除去酶解液中部分單糖,離心后取上清液,向其緩慢倒入95%乙醇溶液直至溶液乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%,靜置24 h,沉淀多聚寡糖。經(jīng)酵母發(fā)酵、乙醇沉淀初步處理后的酶解液通過(guò)分子質(zhì)量(Mw)分別為1,3,5,10 kDa的超濾膜繼續(xù)分離,得到5種不同分子質(zhì)量段的酶解濾液U1(010 kDa)。

1.3.4 抑菌活性測(cè)定

試驗(yàn)菌株經(jīng)活化培養(yǎng)后,用已滅過(guò)菌的移液管移取10 mL無(wú)菌生理鹽水至斜面試管內(nèi),在無(wú)菌操作條件下用接種環(huán)小心將菌苔洗下。倒入帶有玻璃珠的燒瓶?jī)?nèi),將菌懸液打散,保證活菌數(shù)的均一性,稀釋得到活菌數(shù)為1×107～1×108cfu/mL的菌懸液。

1) 不同分子質(zhì)量段的UPO的抑菌活性測(cè)定

采用牛津杯法[18]測(cè)定不同分子質(zhì)量段UPO的抑菌圈直徑。首先吸取0.2 mL菌懸液至無(wú)菌固體培養(yǎng)基平板上,并用無(wú)菌涂布棒涂布均勻,然后將3個(gè)無(wú)菌牛津杯平穩(wěn)放置于培養(yǎng)基表面上,保證各牛津杯之間距離相當(dāng)。用移液槍移取200 μL配置好的一定濃度的UPO溶液至牛津杯中,以pH 6.8的緩沖液作為空白對(duì)照。每個(gè)分子質(zhì)量段低聚糖溶液重復(fù)做3次,最后將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)皿測(cè)量抑菌圈直徑大小,并取3組實(shí)驗(yàn)值的平均值作為記錄。

2) UPO與市售防腐劑的復(fù)配實(shí)驗(yàn)

取抑菌效果最佳分子質(zhì)量段的UPO(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)與市售防腐劑(山梨酸鉀、苯甲酸鈉和乳酸鏈球菌素;質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)以1∶1體積比復(fù)配,比較復(fù)配抑菌劑與單一組分抑菌劑的抑菌效果。采用牛津杯法測(cè)定抑菌圈直徑。由于一般食品防腐劑均在酸性條件下具備良好的抑菌活性[19],故本實(shí)驗(yàn)抑菌劑均于pH 4.2的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中溶解,同時(shí)以pH 4.2的緩沖液作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶法提取UPO條件優(yōu)化

果膠裂解酶(PL)通過(guò)β-消除反應(yīng)作用于果膠底物,在新形成的非還原性末端的C-4和C-5原子間形成一個(gè)雙鍵,該產(chǎn)物在235 nm處存在最大光吸收值。此外,PL在降解果膠的過(guò)程中,先降解成不飽和多聚寡糖,再解聚為不飽和低聚寡糖和部分單糖,因此,酶解液中還原糖質(zhì)量濃度的多少可以作為果膠水解程度的參考指標(biāo)如圖1所示。

由圖1(a)可知:酶添加量為20～40 U/mL時(shí),還原糖質(zhì)量濃度增加較快;酶添加量為40～120 U/mL時(shí),還原糖質(zhì)量濃度增加緩慢;酶添加量為120～160 U/mL時(shí),還原糖質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng),底物濃度越低,水解產(chǎn)物增多,不利于酶解反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行[20]。因此,酶添加量達(dá)到一定值時(shí),還原糖質(zhì)量濃度上升速度變慢,逐漸趨于平穩(wěn),考慮后續(xù)生產(chǎn)成本因素,確定PL酶添加量為120 U/mL。由圖1(b)可知:當(dāng)pH上升至6.2時(shí),還原糖質(zhì)量濃度最大,達(dá)到880 μg/mL,之后呈下降趨勢(shì)。由圖1(c)可知:PL酸酶法水解桔皮果渣的適宜溫度在40～50 ℃,當(dāng)溫度為45 ℃時(shí),還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到最高785 μg/mL,隨后還原糖質(zhì)量濃度隨溫度升高逐漸減少,引起這一結(jié)果的原因是PL在40～50 ℃酶活較高且穩(wěn)定性好,而當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí),PL酶活力明顯下降,導(dǎo)致酶解反應(yīng)減弱,還原糖質(zhì)量濃度減少。由圖1(d)可知:反應(yīng)時(shí)間為1～5 h時(shí),還原糖質(zhì)量濃度隨著反應(yīng)時(shí)間增加而明顯增加,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為5 h時(shí),還原糖質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定,之后還原糖質(zhì)量濃度雖有所增加,但上升趨勢(shì)緩慢,由此確定PL酶解的最適反應(yīng)時(shí)間為5 h。

2.2 酶法水解桔皮果渣正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)分析不同因素間的相互關(guān)系,最終確定PL酶解桔皮果渣的最佳酶解條件,其結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)確定反應(yīng)體系中果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,故正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)只考慮pH、酶添加量、反應(yīng)時(shí)間和酶解溫度4個(gè)因素,正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo),由極差分析可知:各因素對(duì)桔皮果渣酶解程度影響的主次順序?yàn)镃>D>A>B,即反應(yīng)時(shí)間>酶解溫度>酶添加量>pH,反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖質(zhì)量濃度的影響最為顯著。確定PL酶解果渣的最佳條件是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的果膠溶液,加酶量160 U/mL,反應(yīng)pH 6.2,溫度40 ℃,反應(yīng)時(shí)間5 h。對(duì)最佳酶解工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得到還原糖質(zhì)量濃度為1 067 μg/mL(得率為72.9%)。

2.3 不同分子質(zhì)量段的UPO的抑菌活性

不同分子質(zhì)量段的果膠低聚糖產(chǎn)物往往會(huì)產(chǎn)生不同的抑菌效果,通過(guò)對(duì)比抑菌圈直徑,分析不同分子質(zhì)量段UPO(U1,U2,U3,U4,U5)對(duì)3種常見(jiàn)食品污染細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)抑菌活性的影響如圖2所示。

圖2 不同分子質(zhì)量段的UPO抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of unsaturated pectin oligosaccharides with different molecular weights

由圖2分析可知:不同分子質(zhì)量段UPO對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有一定的抑菌作用,但抑菌效果也存在明顯差異,其中U2(1 kDa

2.4 UPO與市售防腐劑的復(fù)配實(shí)驗(yàn)

選取具有最佳抑菌效果的UPO(分子質(zhì)量段為U2),通過(guò)對(duì)比抑菌圈直徑,分析其與3種市售防腐劑單獨(dú)使用和復(fù)配使用,分別對(duì)3種常見(jiàn)食品污染細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)抑菌活性的影響如表3所示。

表3 UPO與食品防腐劑復(fù)配抑菌活性

由表3可知:UPO及市售食品防腐劑對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果存在差異。單一組分的抑菌效果表明了苯甲酸鈉和乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強(qiáng),而山梨酸鉀則對(duì)大腸桿菌具有較好的抑制效果。UPO的抑菌性能相比于3種市售食品防腐劑較弱,但在與3種防腐劑復(fù)配后,復(fù)配抑菌劑產(chǎn)生的抑菌圈直徑明顯增大,超過(guò)3種防腐劑單獨(dú)作用時(shí)的抑菌效果?？梢?jiàn)UPO在與某種有缺陷的防腐劑復(fù)配使用后,有一定的增強(qiáng)該防腐劑抑菌效果的能力。因此,UPO有望與市售食品防腐劑復(fù)配使用,解決化學(xué)防腐劑的高毒性和生物防腐劑的高成本問(wèn)題。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素及正交試驗(yàn),確定了PL酶解桔皮果渣的最佳工藝條件為pH 6.2,酶添加量160 U/mL,果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,酶解溫度40 ℃,時(shí)間5 h,對(duì)最佳酶解工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得到還原糖質(zhì)量濃度為1 067 μg/mL(得率為72.9%)。不同分子質(zhì)量段的UPO對(duì)常見(jiàn)食品污染細(xì)菌的抑菌實(shí)驗(yàn)表明:其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有一定的抑菌作用,其中U2(1 kDa