一種新型離子液體對(duì)L-纈氨酸發(fā)酵的影響

劉景陽,劉云鵬,徐慶陽,陳 寧

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457)

L-纈氨酸與L-亮氨酸、L-異亮氨酸合稱為支鏈氨基酸,是人體和動(dòng)物體必需氨基酸,是蛋白質(zhì)合成原料,同時(shí)還具有特殊的生理和生物學(xué)功能,也可以用作生物體能源[1]。目前,L-纈氨酸主要應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料、洗滌劑和除草劑等領(lǐng)域[2-4],由于應(yīng)用領(lǐng)域范圍廣,其需求量日益增長。L-纈氨酸獲取的途徑主要有蛋白質(zhì)水解提取法、酶催化法、微生物發(fā)酵法以及化學(xué)合成法[5]。由于微生物發(fā)酵法有原料便宜、反應(yīng)條件溫和及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),已成為L-纈氨酸大規(guī)模生產(chǎn)的主要方法。離子液體在許多領(lǐng)域都有應(yīng)用,如生物催化[6]、潤滑[7]、電化學(xué)[8]、生物柴油的生產(chǎn)和純化[9]、脂肪族和芳香族的分離[10]等。

低熔點(diǎn)共熔溶劑(DESs)是一種新型的離子液體,成本低廉,對(duì)環(huán)境友好,可生物降解,其組成成分廣泛存在于自然界中,便于制備[11]。因此,研究人員對(duì)于DESs在生物催化中的應(yīng)用產(chǎn)生了極大的興趣[12]。同時(shí),在生物催化中,低熔點(diǎn)共熔溶劑可在酶不失活的情況下,能夠增加底物的溶解性,促進(jìn)生物代謝途徑中關(guān)鍵酶催化反應(yīng),提升生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[13]。DESs可通過將兩個(gè)價(jià)格低廉、易于獲取和可生物降解的組分,經(jīng)簡(jiǎn)單的混合,形成低熔點(diǎn)共熔溶劑[14]。最普遍用于形成低熔點(diǎn)共熔溶劑的季銨鹽如氯化膽堿(ChCl)[15-16],與其結(jié)合的氫供體如尿素(U)、可再生的羧酸(草酸、檸檬酸、琥珀酸或者氨基酸)和可再生的多元醇(甘油、糖類)[17-18]。目前關(guān)于離子液體對(duì)L-纈氨酸生產(chǎn)菌的研究較少，筆者為此優(yōu)化了離子液體的添加體積分?jǐn)?shù)及添加時(shí)機(jī),同時(shí)研究了離子液體的添加對(duì)L-纈氨酸生產(chǎn)菌的生長、耗糖及產(chǎn)酸影響,為提高L-纈氨酸產(chǎn)量提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

BrevibacteriumflavumXV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr),天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏菌種。

1.1.2 主要試劑

氯化膽堿、尿素、L-亮氨酸和L-異亮氨酸均購自上海生物工程股份有限公司,蛋白胨、酵母粉和牛肉膏均購自北京奧博星生物技術(shù)股份有限公司,其他分析純化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 溶液配制

培養(yǎng)基配制詳見文獻(xiàn)[19]。

離子液體的配制:準(zhǔn)確稱取一定量的氯化膽堿和尿素,使m(氯化膽堿)∶m(尿素)=1∶2,置于圓底燒瓶混合均勻,100 ℃油浴中攪拌加熱3 h,形成透明、均一的液體后,室溫冷卻備用。

1.2 主要儀器及設(shè)備

5 L和30 L全自動(dòng)發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程公司;SBA-40C生物傳感儀,山東科學(xué)院生物研究所;pH電極、溶氧電極,METTLER TOLEDO;LC20AT高效液相色譜儀,日本Shimadzu公司;TU 1810紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器;FA2204B電子天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 培養(yǎng)方法

菌種活化:將斜面保藏菌種采用劃線的方法接種于活化斜面上,于32 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。

種子培養(yǎng):將活化斜面上生長狀況良好的菌種取一環(huán)接種至30 mL種子培養(yǎng)基中,200 r/min,32 ℃振蕩培養(yǎng)15～18 h。

搖瓶培養(yǎng):將生長好的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,200 r/min,32 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)72 h,pH控制在7.0±0.05。

發(fā)酵罐培養(yǎng):將生長好的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入30 L發(fā)酵罐中,通風(fēng)量1 m3/h,攪拌轉(zhuǎn)速300～600 r/min,培養(yǎng)溫度32 ℃,pH控制在7.0±0.05。

1.3.2 分析方法

菌體量測(cè)定:每隔4 h取適量發(fā)酵液,用滅菌生理鹽水稀釋至適當(dāng)倍數(shù),通過分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長下吸光度。

溶氧及pH測(cè)定:在線電極測(cè)定。

葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定:取適量發(fā)酵液,12 000 r/min離心5 min,取上清液稀釋至適當(dāng)倍數(shù),用生物傳感儀測(cè)定。

L-纈氨酸質(zhì)量濃度測(cè)定:用高效液相色譜法分析測(cè)定,詳見文獻(xiàn)[20]。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。單因素方差分析之后Dunnett檢驗(yàn)來確定數(shù)據(jù)差異的顯著性,P<0.05表示顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-纈氨酸生產(chǎn)菌XV0505的生長曲線的測(cè)定

采用搖瓶發(fā)酵方式,將生長好的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,200 r/min,32 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)72 h,pH控制在7.0±0.05,每隔4 h測(cè)定菌體量OD600,繪制XV0505的生長曲線,結(jié)果如圖1所示。

圖1 黃色短桿菌XV505菌體生長曲線Fig.1 Growth curve of B. flavum XV505 in shake flask

從圖1中可以看出:L-纈氨酸生產(chǎn)菌XV0505在0～8 h,生長較為緩慢,為菌體生長延滯期;12～24 h,生長迅速,為菌體生長對(duì)數(shù)期;32 h后,OD600沒有顯著提升,進(jìn)入生長穩(wěn)定期;發(fā)酵52 h,菌體量OD600達(dá)到了12.5,L-纈氨酸產(chǎn)量為24.3 g/L。

2.2 離子液體添加時(shí)機(jī)及體積分?jǐn)?shù)對(duì)搖瓶分批發(fā)酵XV0505產(chǎn)L-纈氨酸的影響

根據(jù)搖瓶發(fā)酵XV0505的生長曲線,選取3個(gè)不同生長期即延滯期4 h、對(duì)數(shù)期16 h和穩(wěn)定期32 h,添加不同體積分?jǐn)?shù)離子液體0.05%,0.1%,0.15%,0.2%進(jìn)行分批發(fā)酵。空白對(duì)照組為不添加離子液體,添加0.05%,0.1%,0.15%,0.2%的無菌生理鹽水。XV0505發(fā)酵培養(yǎng)52 h,測(cè)定發(fā)酵液中L-纈氨酸的產(chǎn)量,結(jié)果如圖2所示。在菌體生長延滯期,添加不同體積分?jǐn)?shù)的離子液體,對(duì)菌體產(chǎn)L-纈氨酸的能力有一定的抑制作用,表現(xiàn)為L-纈氨酸的產(chǎn)量較空白對(duì)照均降低,且添加離子液體的體積分?jǐn)?shù)越高,L-纈氨酸產(chǎn)量越低。添加離子液體的體積分?jǐn)?shù)為0.05%時(shí),L-纈氨酸的產(chǎn)量為對(duì)照組的86.4%;添加離子液體的體積分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí),L-纈氨酸的產(chǎn)量僅為對(duì)照組的65.4%。在菌體生長對(duì)數(shù)期,添加不同體積分?jǐn)?shù)的離子液體,能夠促進(jìn)菌體生產(chǎn)L-纈氨酸。離子液體添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí),XV0505積累L-纈氨酸產(chǎn)量最高為28.8 g/L,較對(duì)照組提高了18.5%。在菌體生長穩(wěn)定期,離子液體的添加對(duì)XV0505生產(chǎn)L-纈氨酸的影響不顯著。

2.3 添加離子液體對(duì)分批補(bǔ)料發(fā)酵菌體生長的影響

選取搖瓶發(fā)酵最佳的離子液體添加體積分?jǐn)?shù)及時(shí)機(jī),即發(fā)酵16 h,添加離子液體體積分?jǐn)?shù)為0.1%。將生長好的種子液按10%的接種量接入30 L發(fā)酵罐中,通風(fēng)量控制在1 m3/h,攪拌轉(zhuǎn)速控制在300～600 r/min,培養(yǎng)溫度32 ℃,pH控制在7.0±0.05,在此水平下研究離子液體添加對(duì)L-纈氨酸生產(chǎn)菌生長的影響,結(jié)果如圖3所示,其中對(duì)照組添加體積分?jǐn)?shù)0.1%的等體積無菌生理鹽水。在菌體生長對(duì)數(shù)期,添加離子液體,可以使菌體快速的生長,進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間大約提前了4 h,最終菌體量較對(duì)照組提高了3.8%。

2.4 添加離子液體對(duì)分批補(bǔ)料發(fā)酵XV0505糖消耗速率的影響

在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中,底糖質(zhì)量濃度為80 g/L,當(dāng)發(fā)酵液中糖質(zhì)量濃度低于10 g/L時(shí),開始脈沖流加補(bǔ)糖,維持發(fā)酵液動(dòng)態(tài)糖質(zhì)量濃度為10 g/L[21]。離子液體的添加對(duì)XV0505發(fā)酵糖消耗速率的影響如圖4所示。在16 h添加0.1%離子液體后,XV0505生長旺盛,耗糖速率加快,在發(fā)酵20～44 h階段,耗糖速率均高于對(duì)照組。XV0505發(fā)酵24 h耗糖速率達(dá)到峰值為9.8 g/(L·h),較對(duì)照組提高了7.7%。

2.5 添加離子液體對(duì)分批補(bǔ)料發(fā)酵XV0505產(chǎn)L-纈氨酸的影響

在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中,每間隔4 h測(cè)定一次發(fā)酵液中L-纈氨酸產(chǎn)量,結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出:在發(fā)酵前期,菌體生產(chǎn)L-纈氨酸速率較低;發(fā)酵中期,L-纈氨酸產(chǎn)率快速升高,發(fā)酵后期,L-纈氨酸產(chǎn)率逐漸降低。在發(fā)酵16 h時(shí),添加離子液體能顯著增加L-纈氨酸的產(chǎn)量。在發(fā)酵終點(diǎn),對(duì)照組能積累L-纈氨酸產(chǎn)量66.1 g/L,添加離子液體的實(shí)驗(yàn)組則能積累L-纈氨酸產(chǎn)量73.0 g/L,提高了10.4%。從文獻(xiàn)報(bào)道來看[19],利用黃色短桿菌XV0505進(jìn)行L-纈氨酸發(fā)酵,產(chǎn)量能達(dá)到59.12 g/L,與其相比,L-纈氨酸積累能力提高了23.4%?？蛇M(jìn)一步計(jì)算得對(duì)照組的糖酸轉(zhuǎn)化率為25.3%,而添加離子液體的糖酸轉(zhuǎn)化率為26.7%,提高了5.5%。

圖5 添加對(duì)XV0505產(chǎn)L-纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of addition on L-valine yield by XV0505 in fed-batch fermentation

L-纈氨酸產(chǎn)量增加的主要原因有:1) 離子液體加快了菌體的生長,使得菌體的生物量更早達(dá)到峰值,在單位菌體L-纈氨酸產(chǎn)量不變的前提下,菌體量得到提高,則L-纈氨酸單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸量必然增加;2) 添加離子液體能夠使菌體內(nèi)各種酶以及生物大分子的活性增強(qiáng),從而使得耗糖速率增加,在發(fā)酵后期菌體總量一致的前提下,單位菌體單位時(shí)間耗糖速率增大,勢(shì)必導(dǎo)致L-纈氨酸產(chǎn)量的增加。

3 結(jié) 論

低熔點(diǎn)共熔溶劑作為一種新型離子液體,在生物催化領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用,具有改變簡(jiǎn)單節(jié)桿菌細(xì)胞膜通透性,調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝水平等功能。筆者以L-纈氨酸生產(chǎn)菌XV0505為研究對(duì)象,研究了按比例配置的氯化膽堿與尿素離子液體的添加對(duì)XV0505生長、耗糖和產(chǎn)酸的影響。通過搖瓶發(fā)酵,優(yōu)化了離子液體的添加時(shí)機(jī)和添加的體積分?jǐn)?shù),在菌體生長發(fā)酵16 h時(shí),添加0.1%的離子液體,XV0505積累L-纈氨酸量最高,較對(duì)照組提高18.5%。在分批補(bǔ)料發(fā)酵中,發(fā)酵16 h,加入0.1%的離子液體,能顯著促進(jìn)菌體生長,提高糖的消耗速率,最終L-纈氨酸的產(chǎn)量提高了10.4%,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了5.5%。