綿羊HTR4基因的生物信息學(xué)分析

劉佳 王禎 代友超 張小雪

摘要：利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫及軟件，對綿羊羥色胺受體4基因（hydroxytryptamine receptor 4，HTR4）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以初步了解其結(jié)構(gòu)并進(jìn)行功能預(yù)測。結(jié)果表明，綿羊HTR4基因所含最大長度的開放閱讀框為1 317 bp，編碼438個氨基酸殘基。HTR4基因編碼的蛋白分子質(zhì)量為49 437.09 KDa，理論等電點（pI）為8.32。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明其編碼產(chǎn)物主要定位于質(zhì)膜（60.9%），且不屬于分泌蛋白。HTR4蛋白不存在信號肽序列，存在7段跨膜結(jié)構(gòu)且無低復(fù)雜性段區(qū)域，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，且三級結(jié)構(gòu)主要由α折疊纏繞形成。

關(guān)鍵詞：綿羊;HTR4基因;生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S826? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ?文章編號：1001-1463（2020）10-0035-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.10.008

Abstract：The bioinformatics analysis of sheep HTR4 gene was carried out by using bioinformatics database and software， and its structure was preliminarily understood and predicted. The results showed that sheep HTR4 gene contained an open reading frame of 1 317 bp， encoding 438 amino acid residues. The molecular mass of HTR4 protein was 49 437.09 KDa， and the theoretical isoelectric point pI was 8.32. The subcells were mainly located in plasma membrane and did not belong to secretory protein（60.9%）. There are no signal peptide sequences. There are seven segments of transmembrane structure and no segments of low complexity region. The secondary structure is mainly α-helix， and the tertiary structure is mainly formed by α-helix， winding and folding.

Key words：Sheep;HTR4 gene;Bioinformatics analysis

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）既是一種神經(jīng)遞質(zhì)，又是一種血管活性物質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中起著多種生理作用[1 ]。HTR4是其受體一亞型，HTR4 基因在人體內(nèi)定位于5q31-33， 編碼羥色胺受體4 型蛋白[2 ]。該基因在人和鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中都有廣泛的表達(dá)，但在不同的組織中表達(dá)量差異顯著，主要分布在腦組織和腸道組織中，在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有組織中都有表達(dá)，其中腦組織的表達(dá)率顯著高于外周組織[3 ]。外周組織中，小腸的表達(dá)率最高，參與胃腸道的運動與分泌、調(diào)節(jié)蠕動反射及影響腸道感覺功能[4 ]。HTR4參與胃腸道的運動與分泌、調(diào)節(jié)蠕動反射及影響腸道感覺功能[5 ]。外周HTR4的作用首先是在豚鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。在用電刺激豚鼠腸縱行平滑肌叢時，HT作用于一個在藥理學(xué)上與HTR4類似的受體，從而增強(qiáng)膽堿能介導(dǎo)的收縮。其在人和鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中都有廣泛的表達(dá)，但不同組織內(nèi)的表達(dá)量卻有顯著差異，其主要分布在腦組織和胃腸道組織中。

生物信息學(xué)是利用數(shù)學(xué)方法處理和分析生物數(shù)據(jù)，基于人們現(xiàn)有對分子生物學(xué)的認(rèn)識和構(gòu)建生物模型，進(jìn)而分析其生物學(xué)特性的方法[6 ]。對HTR4基因的研究大多為人類HTR4基因及其編碼產(chǎn)物的功能，而綿羊HTR4基因方面的研究不足。本研究以生物基因組數(shù)據(jù)庫調(diào)取的綿羊HTR4的序列為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法對綿羊HTR4基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、序列特征、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測和分析，以期為深入研究HTR4基因及其編碼蛋白的基本結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1? ?材料與方法

1.1? ?序列來源

數(shù)據(jù)來源于NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫，包括綿羊（XM_027970630.1）、狗（XM_ 022417831.1）、雞（XM_015293658.2）、馬（NM_ 001163982.1）、貓（XM_023260627.1）、牛（NM_001040485.1）、兔（XM_008255221.2）、豚鼠（NM_001172963.1）、豬（NM_001001267.1）、人（NM_000870.7）和山羊（XM_018050181. 1）等11個物種的mRNA序列。括號內(nèi)為GenBank登錄號。

1.2? ?方法

綿羊HTR4基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF）采用NCBI的ORF Finder程序分析，參照Kozak法則[7 ];HTR4基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)采用Bioedit及ExPASy分析軟件預(yù)測;亞細(xì)胞定位采用PSORTⅡ預(yù)測[8 ]。蛋白潛在信號肽剪切位點預(yù)測采用Signalp 3.0軟件?？缒ぢ菪齾^(qū)域的預(yù)測采用TMHMM程序。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析采用Smart軟件。采用Prot Scale進(jìn)行蛋白親疏水性分析。二級結(jié)構(gòu)采用Jpred分析預(yù)測。采用Swiss-model軟件分析蛋白三級結(jié)構(gòu)多序列比對及同源性分析采用DNAMAN軟件分析[9 ]。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?綿羊HTR4基因開放閱讀框分析

從開放閱讀框分析結(jié)果（圖1）可以看出，綿羊HTR4基因序列中最大長度的ORF有? 1 317 bp，起始密碼子位于1 bp處，終止密碼子位于1 845 bp處，推測其編碼438個氨基酸殘基。

2.2? ?綿羊HTR4編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括其相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點基因編碼產(chǎn)物半衰期和不穩(wěn)定指數(shù)等[10 ]。對綿羊HTR4基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)的分析結(jié)果表明，綿羊的HTR4基因編碼438個氨基酸殘基，其分子式為C2253H3497N577O605S34，分子質(zhì)量為49 437.09 KDa，理論等電點pI為8.32。其氨基酸組成如圖2所示，其中含量最多的是Leu（亮氨酸），所占比例為10.27%;含量最少的是His（組氨酸），所占比例為1.83%。負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為32，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為37。基因編碼產(chǎn)物半衰期和不穩(wěn)定指數(shù)分別為30 h和51.70，不穩(wěn)定指數(shù)為41.57 > 40.00，由此可確定綿羊HTR4基因編碼產(chǎn)物屬不穩(wěn)定蛋白。

2.3? ?綿羊HTR4蛋白亞細(xì)胞定位

從綿羊HTR4基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果（表1）可以看出，綿羊HTR4蛋白分布于質(zhì)膜的可能性為60.9%，分布于囊泡分泌系統(tǒng)的可能性為17.4%，分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性為8.7%，分布于細(xì)胞核和線粒體的可能性均為4.3%。由此推斷，綿羊HTR4基因主要在質(zhì)膜中發(fā)揮生物學(xué)作用，其次在囊泡分泌系統(tǒng)中發(fā)揮作用。

2.4? ?綿羊HTR4編碼產(chǎn)物的同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

HTR4基因在多個物種中都有表達(dá)。采用DNAMAN對兔、牛、綿羊、山羊、貓、馬、人、豚鼠、豬、狗和雞HTR4蛋白多序列比對的結(jié)果如圖3所示，可以看出，HTR4基因在這11個物種中均有表達(dá)，且綿羊與牛和山羊的HTR4氨基酸序列同源性較高，這也說明了它們在進(jìn)化過程具有較近的親緣關(guān)系。HTR4編碼產(chǎn)物同源樹證明，在分析中選取的11個物種中，綿羊、山羊和牛的同源性最高（圖4）。

2.5? ?綿羊HTR4蛋白潛在信號肽剪切位點預(yù)測

信號肽序列是存在于分泌蛋白基因編碼序列中、在起始密碼子之后的1段富含疏水氨基酸多肽的序列。蛋白質(zhì)的合成是在核糖體上進(jìn)行，信號肽是蛋白質(zhì)的1個片段，引導(dǎo)核糖體并定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個通道上，使核糖體附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并將不斷伸長的蛋白質(zhì)鏈穿透通過通道，隨后信號肽被切割下來，合成的蛋白質(zhì)被釋放進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，最后被轉(zhuǎn)運到胞外[11 ]。通過檢測綿羊HTR4蛋白潛在信號肽的存在情況可以得知該基因編的產(chǎn)物是否是分泌蛋白和跨膜蛋白以及跨膜蛋白的基本信息。從圖5可以看出，綿羊HTR4基因編碼產(chǎn)物的C值、Y值和S值分別為0.619、0.058和0.463。因此推斷HTR4基因的編碼產(chǎn)物不存在信號肽，但發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)，故該蛋白既是非分泌性蛋白又是跨膜蛋白。

2.6? ?綿羊HTR4蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測

從TMHMM 2.0軟件的分析結(jié)果（圖6）可以看出，HTR4基因編碼的蛋白質(zhì)是跨膜蛋白，該基因編碼的蛋白有7段跨膜區(qū)間，分別是145～167、180～202、217～239、259～281、314～336、383～401和416～438。

2.7? ?綿羊HTR4蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

由綿羊HTR4蛋白潛在信號肽剪切位點預(yù)測已知綿羊HTR4基因編碼的蛋白是跨膜蛋白，通過Smart軟件分析，綿羊HTR4有7段跨膜結(jié)構(gòu)，分別是72～94、107～129、144～166、186～208、241～263、310～328、343～365（圖7、圖8）。

2.8? ?綿羊HTR4蛋白親疏水性分析

研究發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白疏水性最大值為2.878（第82位），最小值為-3.078（第384位），由此得出該基因編碼的蛋白屬于親水蛋白（圖9）。

2.9? ?綿羊HTR4蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)（secondary structure）是指蛋白質(zhì)第一個水平的折疊，即部分蛋白質(zhì)鏈折疊形成一些通用結(jié)構(gòu)，這些通用結(jié)構(gòu)在所有蛋白質(zhì)中都能找到[12 ]。通過Jpred軟件分析可知（圖10）綿羊HTR4蛋白二級結(jié)構(gòu)α螺旋（α-helix，Hh）、β折疊（β-sheet，Ee）和無規(guī)卷曲（random coil，Cc）分別有243、9和188段，分別占比55.22%、2.05%和42.73%，可見綿羊HTR4蛋白二級結(jié)以α卷曲為主。

2.10? ?綿羊HTR4蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

三級結(jié)構(gòu)（tertiary structure）是指蛋白質(zhì)在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的進(jìn)一步折疊，通過將二級結(jié)構(gòu)元素組裝在一起形成每個蛋白質(zhì)特有的三維構(gòu)象[12 ]。由圖11可知，HTR4基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由α卷曲折疊纏繞形成。

3? ?小結(jié)

綿羊HTR4基因的最長ORF長度為? ? ? 1 317 bp，編碼438個氨基酸殘基;亮氨酸所占比例最多，為10.27%，分子質(zhì)量為49 437.09 KDa，理論等電點（pI）為8.32。HTR4基因編碼的產(chǎn)物為不穩(wěn)定性蛋白，其亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示在質(zhì)膜的可能性最大，為60.9%。HTR4基因編碼產(chǎn)物在多種物種中氨基酸序列高度相似，綿羊與牛、山羊在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近。HTR4基因的編碼產(chǎn)物中不存在信號肽，為非分泌性蛋白但發(fā)現(xiàn)了跨膜區(qū)，故該蛋白是跨膜蛋白。該基因編碼的蛋白有7段跨膜結(jié)構(gòu)。HTR4基因編碼的蛋白為親水蛋白，富含親水氨基酸。綿羊HTR4基因編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主，三級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋折疊纏繞形成。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）