黃芪治療糖尿病腎病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制

饒雅雯， 劉敏， 孫治中

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease）是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，可進(jìn)展為終末期腎病，是糖尿病致死、致殘的主要原因。我國糖尿病腎病在終末期腎病中占16.4%，未來可能會成為終末期腎病的首位病因[1]。而臨床上，糖尿病腎病早期中醫(yī)藥治療的介入，對延緩病情的惡化及發(fā)展有顯著的療效。中醫(yī)學(xué)并沒有糖尿病腎病這一病名，多從 “水腫”“關(guān)格” 方面論治，認(rèn)為其總體病機為本虛標(biāo)實，本虛指氣陰兩虛、臟腑內(nèi)虛，尤其指脾腎兩臟，標(biāo)實多為燥熱、瘀血、痰濁、水濕等。故具有補中益氣、利尿托毒作用的黃芪是其常用的一味中藥。有研究[2]表明，在2 884 篇中醫(yī)治療糖尿病腎病的文獻(xiàn)中，黃芪是出現(xiàn)頻次最高的藥物，達(dá)2 204 次。由于中藥成分具有多樣性，目前，黃芪的研究多針對其中某一成分，其具體機制尚不明確。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對藥物的有效成分進(jìn)行多靶點、多通路的生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)圖分析[3]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)與方法，對黃芪治療糖尿病腎病的作用機制進(jìn)行研究，以期為下一步的研究提供相關(guān)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1. 1活性成分的獲取以 “黃芪” 為檢索詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索其化學(xué)成分，將口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩查出符合條件的活性成分，點擊其成分的詳細(xì)信息，保存活性成分的2D結(jié)構(gòu)。

1. 2預(yù)測黃芪相關(guān)靶點在Pubchem 數(shù)據(jù)庫中檢索篩選出的黃芪的活性成分，找出它們對應(yīng)的smile號，保存為SDF文件，上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）。 基于反向分子對接原理，依據(jù)成分的2D/3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶點預(yù)測，得到黃芪的預(yù)測靶點。

1. 3糖尿病腎病相關(guān)靶點的獲取及與黃芪預(yù)測靶點的映射以“diabetic kidney disease” 為檢索詞，通過Cards 數(shù)據(jù)庫獲取糖尿病腎病相關(guān)靶點。將黃芪的預(yù)測靶點與糖尿病腎病相關(guān)靶點進(jìn)行映射，得到黃芪治療糖尿病腎病的預(yù)測靶點。

1. 4蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過String數(shù)據(jù)庫獲取黃芪治療糖尿病腎病的預(yù)測靶點之間的 “蛋白-蛋白” 相關(guān)作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件作為黃芪治療糖尿病腎病的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1. 5 Hub網(wǎng)絡(luò)的提取通過Cytoscape 3.6.0 軟件Tools 模塊中NetworkAnalyzer- Network Analysis-Analyze Network 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析獲取相關(guān)拓?fù)鋮?shù)，選取節(jié)點連接度（Degree）的二倍中位數(shù)、“節(jié)點介度（Betweenness）” 和 “節(jié)點緊密度（Closeness）” 的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，提取出Hub網(wǎng)絡(luò)。

1. 6基因本體論（GO）富集分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析應(yīng)用Cytoscape 3.6.0中ClueGO 插件，選擇Biological Process（生物進(jìn)程），對Hub 網(wǎng)絡(luò)中的靶標(biāo)進(jìn)行GO 富集分析。通過DAVID 網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/）對上述分析結(jié)果進(jìn)行KEGG通路分析、篩選，得到顯著富集（P ＜0.01）的通路，并按照Gene 數(shù)從大到小排序。結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選出治療糖尿病腎病的可能通路。找到其通路上的相關(guān)靶標(biāo)，結(jié)合黃芪的活性成分，構(gòu)建出 “黃芪活性成分-糖尿病腎病靶標(biāo)-KEGG通路” 的網(wǎng)絡(luò)圖。并且選取與黃芪治療糖尿病腎病的相關(guān)通路，使用OmicShare 網(wǎng)站（http：//www.omicshare.com/tools/）繪制通路氣泡圖。

1. 7分子對接驗證成分與靶點的結(jié)合能力運用SystemsDock 網(wǎng) 站（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）對Degree值排名前5位的預(yù)測靶標(biāo)與黃芪活性成分進(jìn)行分子對接，通過比較與原生配體的結(jié)合分值大小來評價結(jié)合的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2. 1黃芪活性成分本研究以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為活性成分篩選條件，共篩選出18 種化合物，其名稱、相關(guān)參數(shù)及化學(xué)結(jié)構(gòu)式見表1。

2. 2黃芪預(yù)測靶點以及活性成分-糖尿病腎病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中篩選出18 種活性化合物對應(yīng)的255 個靶點，依據(jù)成分的2D/3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶點預(yù)測，篩選出853個靶點作為黃芪的預(yù)測靶點。將所得的黃芪預(yù)測靶點與GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取的3 629 個糖尿病腎病相關(guān)靶點相映射，篩選出黃芪可能與糖尿病腎病相關(guān)的靶點278個。

在Cytoscape 3.6.0 軟件中導(dǎo)入黃芪的活性成分與糖尿病腎病相關(guān)的靶點，構(gòu)建黃芪活性成分-糖尿病腎病靶點網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1）。如圖1 所示，此網(wǎng)絡(luò)中共包括296 個節(jié)點，其中包括18 個化合物和278個靶點，746條邊。

表1 黃芪活性成分Table 1 Data of the active components of Radix Astragali

2. 3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將278個黃芪可能與糖尿病腎病相關(guān)的靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫得到蛋白-蛋白相關(guān)作用關(guān)系，通過Cytoscape 3.6.0 軟件，形成黃芪治療糖尿病腎病的PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖2）。如圖2 所示，此網(wǎng)絡(luò)中共包括278 個節(jié)點，1 208 條邊。圖中節(jié)點大小是按Degree 值的大小形成，Degree 值越大，節(jié)點越大。

圖1 黃芪活性成分-糖尿病腎病靶點網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Network of active ingredients from Radix Astragali-diabetic kidney disease targets

圖2 黃芪治療糖尿病腎病的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI network of Radix Astragali for treatment of diabetic kidney disease

2. 4 Hub網(wǎng)絡(luò)的提取及Hub中的靶標(biāo)選取Degree的二倍中位數(shù)、 Betweenness 和Closeness 的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，通過Cytoscape 3.6.0 軟件得到Hub中的靶標(biāo)，即黃芪治療的糖尿病腎病關(guān)鍵靶點，提取出Hub網(wǎng)絡(luò)（見圖3）。

圖3 Hub網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Hub network

結(jié)果關(guān)鍵靶點有12個，具體為蛋白激酶Bα亞型（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、 絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、熱休克蛋白90α（HSP90α）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（JUN）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（CASP3）。

2. 5 GO富集分析應(yīng)用Cytoscape 3.6.0 中的ClueGO 插件，進(jìn)行GO 富集中的BP 分析，得到13 個功能組別（見圖4）以及其占比餅狀圖（見圖5）。結(jié)果中主要富集在MAPK cascade、peptidyl-tyrosine phosphorylation、myeloid cell differentlation、negative regulation of protein modifitication process 等功能組別上。

圖4 GO富集分析功能組別圖Figure 4 Functional group diagram for GO enrichment analysis

圖5 GO富集分析功能組別占比餅狀圖Figure 5 Pie chart for functional group proportion by GO enrichment analysis

2. 6 KEGG通路分析通過KEGG 通路分析得到86 條通路，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選出治療糖尿病腎病的可能通路為16 條，繪制通路氣泡圖（見圖6）：Smad 信號通路、蛋白激酶B（AKT）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路、Wnt 信號通路，mTOR 信號通路、酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）信號通路、一氧化氮合酶（NOS）信號通路、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信號通路、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路、核因子kappaB（NF-κB）信號通路、環(huán)鳥苷酸—蛋白激酶G（cGMP-PKG）信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號通路、Toll 樣受體4（TLR4）信號通路、胰島素生長因子（IGF）信號通路。

2. 7分子對接運用SystemsDock 網(wǎng)站對Degree值排名前5位的預(yù)測靶標(biāo)與黃芪活性成分進(jìn)行分子對接，根據(jù)DockingScore 值的大小通過GraphPiad Prism 7.0 軟件制作出熱圖（見圖7）。DockingScore值在4.25 以上認(rèn)為分子與靶點有一定的結(jié)合活性，大于5.0 說明有較好結(jié)合活性，大于7.0 說明具有強烈的結(jié)合活性。熱圖結(jié)果顯示，大部分Docking Score值高于4.25，提示黃芪活性成分與預(yù)測靶標(biāo)有一定的結(jié)合能力。

圖6 KEGG通路氣泡圖Figure 6 Bubble diagram for the KEGG pathway enrichment

3 討論

目前針對黃芪的研究局限于單一成分、單靶點，其具體機制尚不明確，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從分子水平對黃芪治療糖尿病腎病的作用機制進(jìn)行預(yù)測分析。

圖7 黃芪治療糖尿病腎病預(yù)測靶標(biāo)與活性成分分子對接熱圖Figure 7 Heat map for molecular docking of predicted targets with active ingredients

預(yù)測結(jié)果表明，黃芪治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點有12 個，具體為AKT1、TNF、IL6、MAPK3、VEGF、MAPK1、MMP9、MAPK8、mTOR、HSP90α、JUN、CASP3。

其中，AKT1參與了蛋白合成、血管形成等機體新陳代謝細(xì)胞應(yīng)答過程，故其導(dǎo)致糖尿病腎病發(fā)生主要與引起過度的細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)沉積相關(guān)[4]。TNF 則是通過啟動一系列的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膜損傷，腎小球濾過屏障受損，從而形成蛋白尿[5]。IL-6的過度表達(dá)，會導(dǎo)致腎小球系膜增生、腎小球基底膜厚度增加，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[6]。MAPK3、MAPK1、MAPK8 在糖尿病腎病的發(fā)病過程中，可能參與腎小球系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腎小球細(xì)胞外基質(zhì)堆積，造成腎小球硬化[7]。VEGF 可能與足細(xì)胞損傷相關(guān)，并可增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流[8]。有研究[9]表明，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞高表達(dá)MMP9，且可能主要在浸潤巨噬細(xì)胞、小管上皮細(xì)胞、足突狀細(xì)胞、小球系膜細(xì)胞等處[10]。mTOR 導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生可能與抑制足細(xì)胞自噬反應(yīng)相關(guān)[11]。HSP90α 可能通過影響eNOS 活性，引起內(nèi)皮功能障礙[12]。而轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子JUN 表達(dá)的增加，會誘導(dǎo)Nephrin 表達(dá)下調(diào)，引起足細(xì)胞功能異常[13]。

KEGG 富集通路分析發(fā)現(xiàn)16 條通路與糖尿病腎病發(fā)病密切相關(guān)，大多數(shù)已有臨床或?qū)嶒炑芯孔C據(jù)支持，少部分仍有待于進(jìn)一步研究。Smad 信號通路主要是通過TGF-β1這一被公認(rèn)為是具有致纖維化的細(xì)胞因子，參與糖尿病腎病中腎間質(zhì)纖維化的過程[14]。PI3K 通路是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，與葡萄糖代謝有著密切關(guān)系，PI3K 信號通路、AKT 信號通路在調(diào)控絲氨酸蛋白激酶-3β，進(jìn)而在糖尿病腎病系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面扮演重要的角色[15]。而PI3K/AKT通路的關(guān)鍵下游因子是NF-κB，NF-κB 信號通路的激活，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥因子不斷釋放，加速糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[16]。Wnt信號通路在糖尿病腎病病程中，一是通過β-catenin 的大量合成，激活促纖維化因子的釋放，導(dǎo)致腎組織纖維化，二是Wnt-1 高表達(dá)，可誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，并加劇腎細(xì)胞的凋亡[17]。機體自身可以通過自噬調(diào)節(jié)減輕高血糖、高胰島素血癥等應(yīng)激所導(dǎo)致的損傷，但mTOR信號通路的激活可能抑制機體的自噬調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致腎臟纖維化[18]。糖尿病腎病持續(xù)的高糖環(huán)境會激活JAK/STAT 信號通路，導(dǎo)致腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞大量增殖，引發(fā)腎間質(zhì)纖維化[19]。JNK 通路能夠被糖尿病腎病患者機體內(nèi)應(yīng)激、炎性細(xì)胞因子等多種因素激活，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，引起腎小球濾過功能障礙[20]。ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可在高糖環(huán)境下被激活，引起細(xì)胞肥大及TGF-β 的表達(dá)上調(diào)，損傷足細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生[21]。糖尿病腎病患者由于長期高血糖及代謝紊亂，使機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，激活MAPK信號通路，既可介導(dǎo)TGF-β1誘生的系膜區(qū)基質(zhì)沉積，也可進(jìn)一步活化細(xì)胞凋亡因子Caspase-3，引起足細(xì)胞凋亡[22]。cAMP 信號通路可能是通過激活體內(nèi)蛋白激酶A（PKA），調(diào)控水通道蛋白5（AQP5），影響尿液的濃縮稀釋功能，最終造成腎小球濾過功能障礙[23]。TLR4 信號通路是Toll樣受體信號通路中的一類，是介導(dǎo)炎性反應(yīng)信號通路，巨噬細(xì)胞的浸潤導(dǎo)致腎間質(zhì)單核細(xì)胞局部廣泛聚集，且與腎小球硬化指數(shù)和程度呈正相關(guān)[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，IGF 信號通路可以抑制糖尿病腎病中腎小管上皮間質(zhì)細(xì)胞分化[25]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法和技術(shù)，預(yù)測了黃芪通過多成分、多靶點、多通路治療糖尿病腎病的作用機制，認(rèn)為黃芪可能是通過抑制促纖維因子的釋放，抑制炎癥因子分泌，參與抗炎反應(yīng)，調(diào)節(jié)自噬功能，降低氧化應(yīng)激等，進(jìn)而改善糖尿病腎病腎功能，延緩病情發(fā)展。此為進(jìn)一步深入探討黃芪治療糖尿病腎病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制指明了研究方向。